POINT!

　運動は骨粗鬆症を予防し免疫機能を向上させることが知られているが、そのメカニズムの多くは不明であった。著者らは、１分子あたり最も高いエネルギーを生み出す脂肪酸β酸化（FAO）・脂質代謝に着目し、骨髄脂肪組織（BMAT）の分解が骨芽細胞やリンパ球の産生・機能の維持に関わるかを調べた。脂肪分解酵素であるAtglに対するshRNAをFabp4プロモーター下流で発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）を両側骨髄内に注入したところ、運動によって誘導される骨髄脂肪細胞の数とサイズの減少がキャンセルされた。さらに、運動によって上昇する海綿骨量や皮質骨厚、共通リンパ系前駆細胞（CLP）の頻度がAtglノックダウンによりキャンセルされ、非運動群でもAtglノックダウンにより有意に減少した。次に、著者らは力学的免荷と加齢の両方によって誘導される脂質代謝異常に関与する調節因子を特定することとした。老齢ラットの骨髄上清において発現変動する因子と運動したラットにおいて発現変動するタンパク質のうち、Reticulocalbin-2（RCN2）のみが共通して変化していた。RCN2は運動したラット骨髄に多く発現し、老齢ラットでは減少していた。リコンビナントRCN2（rRCN2）刺激を行うと、BMSC由来脂肪細胞のグリセロールとNEFAsの遊離が促進され、脂肪分解酵素の発現が上昇した。次に、RCN2の産生源について検討したところ、RCN2は骨髄を含む様々な組織で発現しており、特に骨髄ではマクロファージがBMSCや骨芽細胞と比較して高い発現を示し、in vitroの力学的刺激やin vivoの運動により発現上昇した。一方、加齢により骨髄マクロファージにおけるRCN2の発現が減少した。マクロファージでRcn2を欠損させたマウス（Lyz2^Cre Rcn2^flox/flox）は定常状態では骨に変化がない一方、運動によって上昇する海綿骨量やオステオカルシン陽性骨芽細胞数、CLP頻度の上昇が抑制された。さらに、これらのマウスでは運動によって誘導される骨髄脂肪細胞数とサイズの減少が観察されなかった。次に、RCN2を介した骨形成およびリンパ球生成の増強に脂肪分解が必要かどうかを調べるため、AAV-shAtglを骨髄腔に注入し、さらにこれらのマウスにrRCN2を投与した。rRCN2は骨形成を促進し骨髄のCLP頻度を上昇させたが、Atglノックダウンによりこれらの効果がキャンセルされた。また、rRCN2がBMSCにおけるFAO関連遺伝子発現を促進することなども明らかにされた。以上から、RCN2はBMATの脂肪分解を刺激し、FAOに直接作用して骨形成を促進すると推測される。

　cAMP-PKAシグナル伝達の活性化は、脂肪分解を活性化するメカニズムとしてよく知られており、RCN2も脂肪細胞におけるcAMP-PKAシグナル活性化を誘導することが明らかとなった。RCN2の受容体を同定するために、標識したRCN2とインキュベートした3T3-L1細胞から分離した膜タンパク質を用いてLC-MS/MS解析を実施した。同定されたタンパク質のうち、Neuropilin-2（NRP2）とインテグリンβ1の発現が他に比べて高かったことからこれらの受容体に着目した。実際にRCN2はNRP2に結合し、siRNAによってNrp2またはItgb1をノックダウンすると、rRCN2刺激によって誘導されるcAMP-PKAシグナル活性化が著しく抑制され脂肪分解酵素発現上昇がキャンセルされた。

　運動が骨髄マクロファージからのRCN2分泌を促進することをさらに詳しく調べるために、尾部懸垂免荷モデルを用いた。力学的刺激の低下は骨髄におけるRCN2発現の低下を誘導し、これらのマウスにrRCN2タンパク質を投与すると、尾部懸垂によって誘導される骨髄脂肪数・サイズ上昇や骨量低下、オステオカルシン陽性骨芽細胞数低下、骨髄CLP頻度減少を抑制することが示された。さらに、rRCN2の老齢マウスに対する投与でも同様の結果が得られた。以上の結果から、RCN2は骨に存在する細胞のエネルギー恒常性維持における新規の力学的刺激感受性脂肪分解因子であり、骨と免疫に寄与する有望な創薬ターゲットであることが判明した。

POINT!

　骨吸収の活性化と骨形成の抑制による溶骨性骨破壊が多発性骨髄腫の特徴である。しかし、骨髄腫の微小環境下における破骨細胞や骨芽細胞の分化・活性化に対する骨細胞の役割は不明な点が残されていた。著者らは、多発性骨髄腫細胞株Vk12598を大腿骨内に移入したマウスから採取した骨細胞のRNA-seq解析から、骨髄腫によって骨細胞で発現上昇する4つの候補遺伝子を同定した。それらのうち、Ciita発現量のみが骨量や骨形成、骨芽細胞面と負の相関を示し、破骨細胞面や骨吸収と正の相関を示したことから、骨細胞CIITAに着目した。Dmp1-cre/ERT2 Ciita2^flox/floxマウスは通常の骨量を示した一方、Vk12598移入モデル骨髄腫による骨量低下は著しく抑制された。初代骨細胞と骨髄腫細胞との共培養によって、RANKLやスクレロスチンの発現が上昇したが、CIITA欠損骨細胞ではこの上昇が抑制されていた。骨髄腫細胞はチミジンホスホリラーゼ（TP）を高発現することで2-デオキシ-D-リボース（2DDR）を分泌しており、これらは骨髄腫における骨疾患の病態に重要な役割を果たすことが知られていることから著者らはこの経路に着目した。2DDRをin vitroで添加すると、骨細胞から分泌されるRANKLやスクレロスチンなどに加え、CIITAの発現が有意に増加した。2DDRによって誘導される細胞内シグナル伝達経路を調べたところ、リン酸化SykとSTAT1レベルの上昇が観察された。2DDRの受容体としてインテグリンαvβ3が知られており、骨細胞でも発現していることから抗インテグリンαv抗体を添加すると、2DDRによって誘導されるSyk、STAT1リン酸化、Ciita、Tnfsf11およびSost発現上昇が抑制された。さらに2DDR刺激によりリン酸化STAT1がIrf1プロモーターやCiitaプロモーターに結合すること、STAT1阻害剤フルダラビンにより、2DDR刺激によるCiita、Tnfsf11、Sost発現上昇が有意に抑制されることも示された。

　CIITAは、MHC class IIプロモーターにおけるヒストンアセチルトランスフェラーゼとしてよく知られているが、それ以外の遺伝子制御機構は不明な点が残されていた。2DDR添加によりH4やH3K27ではなくH3K14アセチル化レベルが上昇した。さらに、2DDR刺激した骨細胞において、Tnfsf11やSostプロモーターにH3K14アセチル化とCIITAの結合がみられた。CIITAはDNAに結合しない転写活性化因子であることから、著者らは質量分析法を用いてCIITAとプロモーター領域を媒介するタンパク質としてAP2αを同定した。AP2αはTnfsf11およびSostプロモーターに結合し、AP2αのノックダウンによって2DDR刺激後のTnfsf11やSostプロモーターにおけるH3K14アセチル化とCIITAの結合レベルの低下が観察された。すなわち、AP2αがCIITAをTnfsf11やSostプロモーターにリクルートし、プロモーターにおけるヒストンアセチル化を誘導していることが示唆された。最後に、骨髄腫患者由来骨生検における骨細胞での抗CIITA抗体染色Hスコア（陽性細胞率、染色強度を併せたスコア）と骨病変数、骨髄液中RANKL・スクレロスチンレベルに正の相関があることなどが示された。以上から、本研究は骨髄腫における骨溶解の理解を広げ、インテグリンαv/STAT1/CIITAシグナル経路を標的とすることが、骨髄腫誘導性骨疾患の治療戦略として可能性があることを示している。

POINT!

　骨髄脂肪細胞（BMAd）の脂肪分解が骨のホメオスタシスにおいて果たす役割を調べるために、BMAd特異的Creマウスを作製した。一般的に使用されるAdipoq-Creを用いた方法では、白色脂肪細胞、骨芽細胞、骨髄間質細胞などの他の細胞で組換えが起こってしまうことから、著者らはCRISPRによってOsterix locusにOsterix-P2A-FLPo（コドン最適化FLPリコンビナーゼ）をノックインしたOsterix-FLPoマウスおよびAdipoqの3’ UTRにIRES-F3-Frt-reversed Cre-F3-FrtをノックインしたFLPo依存的Adipoq-Cre（FAC）マウスを作製し、Osterixを発現し、その後もしくは同時にAdipoqを発現する細胞でのみCreが発現するマウスモデルを構築した。mT/mGマウスとの交配により、これらのマウスでは他の白色脂肪組織や褐色脂肪、骨芽細胞ではなく、BMAd（および一部の他の細胞）でのみCreが発現することが示され、BMAd-Creマウス作製に成功した。

　脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL、Pnpla2遺伝子）は脂肪分解プロセスの最初の酵素であり、律速酵素でもある。そこで、BMAdの脂肪分解が骨代謝や造血に及ぼす生理的機能を明らかにするために、Pnpla2をBMAd特異的に欠失させたBMAd-Pnpla2^–/–マウスを作製し、BMAdの脂肪分解が骨代謝や造血に及ぼす影響を検討した。BMAd-Pnpla2^–/–マウス骨髄では脂肪分解が阻害され、BMAd数の増加や肥大化が観察された。にもかかわらず、これらのマウスで海綿骨量、骨密度、血球系細胞に以上はみとめられなかった。一方、カロリー制限を行ったところ、BMAd-Pnpla2^–/–マウスは骨芽細胞による類骨産生の低下により海綿骨量、骨密度などが低下し、骨髄の血球系細胞についても好中球の割合が減少することが示された。さらに、放射線照射後の造血系細胞の回復を評価したところ、通常食マウスではBMAd脂肪分解の欠損による影響を受けなかったが、カロリー制限を行うと骨髄細胞数や単球、好中球の減少が確認された。

　著者らは骨髄脂肪組織のRNA-seq解析を行い、Pnpla2の欠損は通常食マウスでの遺伝子発現はそれほど変化させなかったが、カロリー制限下では多くの遺伝子発現変動が確認された。特に、カロリー制限により細胞外マトリックス構築と骨格系発生に関連する遺伝子の上昇が引き起こされ、これらには骨芽細胞で発現するAlpl、Col1a1およびCol1a2を含めた複数のコラーゲン遺伝子、さらにFgf/FgfrおよびWntシグナル関連分子、Lox、Adamtsファミリーが含まれていた。以上のデータから、食餌エネルギーが制限された条件下で、BMAdは類骨産生のためのコラーゲンの分泌を含む骨芽細胞機能を維持するためのエネルギーを供給していることが示唆された。また、BMAd由来のエネルギー供給は、損傷時の骨再生や寒冷曝露による骨量の維持にも必要であることも示された。以上から、骨髄脂肪細胞由来のエネルギーはカロリー制限下で骨恒常性などに寄与していることが示唆された。

POINT!

高齢化率が上昇し続ける我が国では、転倒、骨折、寝たきりのリスクとなるサルコペニアや骨粗鬆症に対する治療薬の開発ニーズが高い。多くの基礎疾患を抱える高齢者の服薬アドヒランスを考えると、筋と骨の両方を単剤で治療できるのが理想的である。しかし、現状そのような薬剤は存在しない。著者らは、独自に開発したスクリーニング法により、ケミカルライブラリから筋細胞分化と骨芽細胞分化を促進し、破骨細胞の形成を著しく抑制する化合物を発見し、locamidazole (LAMZ) と命名した。この薬物は経口投与あるいは皮下注射により血中に移行し、明らかな副作用を示すことなく、筋線維幅径の増加と筋機能の向上、そして骨量や骨密度の上昇効果を示した。培養細胞を用いた実験でミトコンドリア関連遺伝子の増加が認められたことから、PGC-1αの関与が示唆された。実際、LAMZはin vitroとin vivoの両方でPGC-1α遺伝子の発現を上昇させ、PGC-1α阻害剤SR18292はLAMZによる筋細胞分化や骨芽細胞分化の促進効果を低減させた。In vivoでも、LAMZと同時にこの阻害剤を投与したところ、筋や骨に対する薬効が消失した。運動により誘導され、PGC-1αを誘導しうるシグナル経路としてカルシウムシグナルが想起されたことから、カルシウムシグナルについての検討が行われた。LAMZ刺激により培養細胞の細胞内カルシウム濃度は増加し、カルシウムシグナルの阻害剤や、シグナル分子Mef2cのノックダウンはLAMZの薬効を減弱した。筋や骨の脆弱化に対してLAMZが治療薬となりうるか、廃用萎縮モデルマウスを用いて検討した。このモデルマウスに対してもLAMZは筋や骨を強化した。以上より、LAMZは運動模倣薬として機能し、運動器疾患治療薬となりうることが示された。

POINT!

αシヌクレインはシナプス前膜に豊富に存在し、ドーパミンの分泌小胞の細胞内輸送を担う。この分子の変異や異常凝集はパーキンソン病やLewy小体型認知症の原因となる。トレッドミルを用いた走行訓練はパーキンソン病患者の運動機能向上に有効である。このことから、運動がαシヌクレインの産生や蓄積に何らかの影響をおよぼすと考えられた。まず、A53T変異ヒトα-シヌクレインBACトランスジェニックマウス(A53Tマウス)の脳内にα-シヌクレインpreformed fibril (PFF) を投与し、病的な修飾体であるpSyn129を増加させた。PFF投与後からトレッドミルによる強制走行を行ったところ、pSyn129量は減少し、臨床的知見と一致した結果が得られた。中脳黒質のドーパミンニューロンはPFF投与によって減少したが、強制走行によって回復した。ドーパミンおよびその代謝産物も同様にPFF投与で減少し、強制走行により回復した。オープンフィールド内での自由行動をトラッキングしたところ、PFF投与により行動量や移動速度が減少した。Rotaロッド試験によって運動機能を評価したところPFF投与マウスは容易に脱落した。これらの異常所見は強制走行によって回復した。老齢マウスの脳内でも上記と同様の所見が見出され、バーンズ迷路を用いた実験ではPFFによる空間記憶低下の強制走行による回復効果が認められた。次に、運動に伴うα-シヌクレインの減少メカニズムを解析した。異常タンパク質の除去にはオートファジーやライソゾームが関与する。PPARファミリー分子はライソゾーム形成に寄与することが知られており、PFF投与マウスの黒質ドーパミンニューロンではPPARα発現が低下する一方、強制走行マウスでは上昇していた。強制走行マウスの脳では、PPARαのTfebプロモーターへの結合活性が増大しており、TFEB発現量とも相関がみられた。オートファジーやライソゾームに関連する遺伝子の発現を解析したところ、TFEBまたはPPARαの標的遺伝子が多く抽出された。この中の一つのCln2をヘテロ欠損するA53Tマウスを作出したところ、αシヌクレインとドーパミンニューロンの減少、運動機能の低下が認められた。同様に、PPARαを欠損するA53Tマウスを作出したところ、これらのマウスでは強制走行を行なっても上記の神経の異常は改善されなかった。治療実験として、アゴニストによるPPARαの活性化を行なったところ、PFFによる神経毒性に対する保護効果が認められた。以上より、運動はPPARαを介してαシヌクレインによる神経疾患に対する治療効果を発揮することが示された。

POINT!

進行性骨化性線維異形成症 (FOP) は、外傷などに伴う組織障害を契機に筋や腱に異所性骨化 (HO) が生じる疾患である。FOP患者にはBMP受容体であるACVR1に種々の変異が認められる。変異型のACVR1は野生型とは異なり、アクチビンAがアゴニストとしてBMPシグナルを活性化することが明らかにされたことから、ACVR1とリガンドの結合を阻害する抗体はHO発症を抑制できると考えられた。ヒトおよびマウスのACVR1に対する結合能と特異性が高く、下流シグナルを阻害する抗体を3クローン作製した。これをタモキシフェン誘導性に変異型のACVR1を発現するマウス (Acvr1^{[R206H]FlEx/+}GT(ROSA26)Sor^CreERT2/+マウス、以下FOPマウス) に用いたところ、驚くべきことにアイソタイプコントロールを投与されたマウスよりも異所性骨の形成が亢進した。これらの抗体は野生型マウスの異所性骨化モデル (熱傷による腱切断) では異所性骨形成を抑制したことから、異所性骨化の増悪は変異型ACVR1により引き起こされると示唆された。ACVR1シグナルは肝臓におけるヘプシジン産生を誘導し、血清中の鉄濃度を低下させることが知られている。抗ACVR1抗体を野生型マウスに投与したところ、ヘプシジン産生は低下し血清鉄が増加したが、FOPマウスでは正反対の結果となった。このことから、抗ACVR1抗体は変異型ACVR1のシグナルを活性化すると考えられた。抗体による変異型ACVR1活性化機構を明らかにするために、BMP-response elementを用いたルシフェラーゼアッセイを行なった。DmrBドメインとダイマー化試薬を用いたホモダイマー化処理を行なったところ、ACVR2B-Fcによる内因性リガンド中和条件下においても変異型ACVR1は下流シグナルを誘導した。このことから、抗ACVR1抗体は変異型ACVR1をダイマー化する可能性が想定された。Fab化抗体であれば受容体のダイマー化は誘導せず、異所性骨化を抑制できることが期待できた。Fab化抗体は半減期が短いことから、これを発現するプラスミドをhydrodynamic deliveryにより遺伝子導入した。その結果、Fab化抗ACVR1抗体を発現するFOPマウスでは異所性骨化が減少した。さらに、FOPマウスのES細胞および線維脂肪前駆細胞 (FAP) を用いた検討を行なった。In vivoの実験結果と矛盾なく、抗ACVR1抗体は変異型ACVR1下流でSmadシグナルを誘導した一方、Fab化抗ACVR1抗体はアクチビンAの作用を阻害した。今回見出されたFOPの異常なシグナルにACVR2A、ACVR2B、BMPR2といったII型の受容体が必要であるか、これらを欠損するFOPマウスES細胞を作出し検討した。その結果、BMP2欠損細胞ではリガンドあるいは抗体誘導性のシグナルに変化はなかったものの、ACVR2AとACVR2Bの両方を欠損する細胞ではSmadシグナルが顕著に抑制された。ヒト患者でも同様の有害事象が起こり得るかを、ヒト化した変異型ACVR1を発現するFOPマウスを作製し、解析を行った。その結果、マウス変異型ACVR1発現マウスの場合よりも軽度ではあるものの抗ACVR1抗体による異所性骨化の増悪が認められた。以上より、FOPのACVR1を標的とする抗体療法を行う際には、何らかの修飾により二量体形成を防ぐ必要がある。

POINT!

胸腺上皮細胞（Thymic epithelial cells: TEC）から構成される特有の微小環境は、T細胞の分化に必須である。単一細胞遺伝子発現解析により、TECは想像以上に不均一な集団であることが明らかにされたが、胸腺上皮細胞前駆細胞の分類や分化経路については不明な点が多い。本研究では、単一細胞RNA発現解析（scRNA-Seq）およびCRISPR/Cas9システムによる新規単一細胞バーコーディンング法を組み合わせることで、マウスにおけるTECの質的および量的変化を継時的に追跡した。具体的には、TECにおいて、Hprt遺伝子にランダムな変異が導入されるマウスを作成し、その変異のパターン（すなわち、バーコード）を読み解いた。その結果、TEC前駆細胞には、皮質上皮細胞（cTEC）または髄質上皮細胞（mTEC）に偏った2種類の前駆細胞が胎生16.5日の胸腺に存在することが示された。これらの細胞の一部は、活性化されておらず休眠の状態にあることがわかった。線維芽細胞増殖因子（FGF）をTECにて過剰発現するマウスでは、出生後１年の胸腺でもTEC前駆細胞が維持されていたことから、オートクラインなFGF刺激がTECの維持に寄与することが示された。本研究は、胸腺微小環境の機能を人為的に調節するための基盤的技術の開発に繋がると考えられる。

POINT!

　骨格筋損傷は極めて協調された筋再生プロセスを開始し、筋の恒常性を再構築する。様々な免疫細胞は筋再生に影響を及ぼすと知られているが、今回の報告では筆者らはcardiotoxinのマウス後肢注射による筋損傷モデルを用いて、γδT細胞が筋再生を促進することを明らかにした。具体的には、筋損傷後においてフローサイトメトリー解析からIL-17A産生 γδT細胞が損傷部位に蓄積することを見出した。ジフテリア毒素受容体を用いた誘導的システムにおいて作製されたgdT細胞(Tcrd)欠失マウスを損傷したところ、筋再生が遅延することがわかった。その機序は、gdT細胞が筋損傷後の急性炎症と筋幹細胞の増殖を促進することにあると筆者らが示した。更に、germ-free (GF)マウスとspecific pathogen-free (SPF)マウスを損傷した結果、GFマウスではgdT細胞が減少していた。SPFマウスに抗生物質を投与するとgdT細胞とIL-17A産生の減少が見られ、筋再生と細菌叢との関連が示唆された。最後に、抗生物質を投与したSPFマウスでは、損傷部位における免疫細胞の蓄積と筋再生の障害が認められたが、IL-17A注射によりレスキューされた。以上から本研究は筋再生はIL-17A産生gdT細胞を介し細菌叢に依存していることを示し、筋にまつわる病態に新たな視点を提供した。

POINT!

内軟骨性骨化と膜性骨化はそれぞれ成長板幹細胞と骨膜幹細胞によって独立して制御されると考えられており、骨膜幹細胞と成長板幹細胞の関係性や相互作用に関しては不明であった。著者らは、タンパク質修飾酵素のひとつであるPRMT5の破骨細胞における機能を探索する目的で、PRMT5 flox/CtsK-Creを作製した。当該マウスでは、内軟骨性骨化と膜性骨化の両方が障害され骨成長障害を呈したものの、破骨細胞の分化や機能、遺伝子発現プロファイルは全く変化しておらず、骨成長障害はCtsK-Creが他の細胞でPRMT5遺伝子を除去したことによる影響と考えらた。原因を探索してゆき、CtsK-Creが骨膜幹細胞でも作動していること、骨膜幹細胞でPRMT5が除去されると、生後徐々に骨膜幹細胞の数が減少してゆくことを明らかにした。これまで、骨膜幹細胞が膜性骨化にのみ寄与すると考えられてきた理由は、①骨膜幹細胞の子孫細胞は、骨内部には侵入せず骨外膜に限局する ②骨膜幹細胞で骨形成に必須の遺伝子Osterixを除去すると、膜性骨化のみが障害される ③骨膜幹細胞を異所性に移植すると、膜性骨化のみ引き起こすという３つの根拠によるものであった。しかしながら、骨膜幹細胞が可溶性因子を分泌することで遠隔的に内軟骨性骨化を制御する可能性に関しては見落とされていた。そこで骨膜幹細胞で高発現する可溶性因子を探索し、骨化制御因子Ihhを同定した。Ctsk-Creを用いて骨膜幹細胞でIhhを除去したマウスを作製したところ、成長版幹細胞の増殖が阻害され、３週齢（ヒトだと幼児期）以降に重篤な骨成長障害を呈した。以上から、可溶性因子を介した「幹細胞クロストーク」が生後の骨成長を制御するという新たな概念が創出され、膜性骨化と内軟骨性骨化システムは互いに相互作用しつつ複雑な骨格系を形成している可能性が示唆された。

POINT!

細菌感染において、炎症性単球と好中球は感染初期に遊走し、細菌の排除に重要な役割を果たすと考えられてきた。しかし、単球は好中球ほど殺菌能が高くないことから、感染のコントロール以外の役割があるのではないかと筆者らは考えた。まず、Staphylococcus aureus (S. aureus)でコートしたアガロースビーズをマウスの皮下に移入し、生体二光子顕微鏡を用いて移入部位の単球、好中球を観察した。移入24時間後において、好中球は移入部位に著しく浸潤しS. aureusと接触していたのに対し、単球は浸潤せず移入部位周辺に留まり、S. aureusとほとんど接触していなかった。しかし、移入7日後においては、単球は移入部位に浸潤しマクロファージへと分化していた。続いて、単球欠損マウスの解析により、単球はS. aureusの排除において有意な影響はなく、感染後の組織修復において重要であることが明らかになった。単球欠損マウスでは、S. aureus移入30日後における組織修復が著しく遅延していた。移入部位は血管が増生しており、厚いコラーゲンの層に覆われていた。さらに、単球欠損マウスでは移入部位の皮下脂肪が肥大しており、脂肪細胞のレプチン産生が亢進していた。そこで、S. aureus移入後にレプチンアンタゴニストを投与したところ、異常血管増生は見られず、組織修復遅延も改善したため、単球欠損によるレプチン産生亢進が異常血管増生および組織修復遅延を引き起こしていると考えられた。野生型マウスのS. aureus移入部位に集積する単球を解析したところ、グレリンの発現が上昇しており、グレリンノックアウトマウスの骨髄を移植したマウスでは、異常血管増生がみられるとともに組織修復が遅延していた。以上の結果から、単球はグレリンの分泌を介して脂肪細胞によるレプチン産生を調整し、感染後組織修復時の血管再生を制御することが示された。

POINT!

腱/靭帯の異所性骨化は、過剰な機械的負荷の繰り返しや炎症によって生じる。腱/靭帯にはプロジェニター細胞が存在し、組織修復能を有することや、その一部がPRG4（proteoglycan4）を発現していることが知られている。しかし、異所性骨化の詳細なメカニズムや腱/靭帯プロジェニター細胞との関係は明らかにされていなかった。筆者らは、プロジェニター細胞の中でもPRG4陽性サブセットが、後縦靱帯骨化症の原因遺伝子の一つで、WNT活性化因子であるRSPO2(R-spondin2)を特異的に発現していること、またRSPO2を発現するプロジェニター細胞が病的環境で腱/靭帯の恒常性維持に寄与していることを示した。まず、マウスのアキレス腱穿刺による異所性骨化モデルを用いてシングルセル解析を行ったところ、PRG4陽性のプロジェニター細胞はRSPO2を特異的に発現していた。シュードタイム解析では、RSPO2クラスターは最も未分化な集団であった。続いて、RSPO2を過剰発現するCAG-EGFP-Rspo2マウスを作製し、アキレス腱穿刺モデルを施行したところ、異所性骨化は抑制された。さらに、後縦靱帯骨化症の患者の靭帯では、脊椎症の患者と比較してRSPO2発現量が有意に低下しており、in vitroの実験では、RSPO2タンパク質はヒト靭帯細胞の軟骨分化を抑制した。またRSPO2は、炎症や機械的負荷によりnuclear factor kBを介して誘導された。以上から、RSPO2を分泌するプロジェニター細胞は、腱/靭帯の修復を制御し、異所性骨化を防いでいることが示された。本研究で同定されたプロジェニター細胞は、後縦靱帯骨化症以外の疾患にも広く関わっている可能性があり、今後さまざまな腱/靭帯の疾患での解析が期待される。

POINT!

胸腺は、骨髄で産生された未熟T細胞から有用かつ自己に反応しないT細胞を選択するのに必須の微小環境である。特に、自己反応性T細胞の排除には胸腺髄質上皮細胞（medullary thymic epithelial cell: mTEC）が主要な役割を果たしており、Aireなどの転写制御因子を用いて多様な自己抗原を異所性に発現させていると報告されてきた。しかし、全身の自己抗原を胸腺内に発現させる仕組みの全貌は未だ解明されていなかった。今回筆者らは、mTECのscATAC-seqとscRNA-seqを組み合わせて、複数の新規mTECサブセットを発見した。それらは末梢組織の分化系統を規定する転写因子によって各々特徴づけられ、末梢の細胞を模倣していることから”mimetic cell”と名付けられた。一例としてM細胞に類似したmicrofold mTECを組織解析やFACSで同定し、転写因子SpiB, Sox8ノックアウトマウスで著減することを示した。また一部のmimetic cell特異的転写因子を発現するTECでのみ、モデル抗原としてYFPを発現させた系で、末梢におけるYFP反応性T細胞が減少することも証明した。以上から、胸腺には末梢の特定の細胞種に類似した上皮細胞サブセットが複数存在し、自己反応性のT細胞を排除することで中枢性免疫寛容に寄与していることが明らかとなった。

POINT!

単一細胞遺伝子発現解析が開発されたことで、数種の臓器については、免疫細胞の構成が明らかにされた。しかし、免疫システムが構築される過程を多臓器に渡り横断的かつ単一細胞レベルで追跡した研究はない。今回、筆者らは、出生前ヒト組織 ( 卵黄嚢、肝臓、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、皮膚、腎臓、腸 ) を用いて単一細胞遺伝子発現解析、単一細胞抗原受容体配列解析、そして空間的遺伝子発現解析を実施し、これらを統合することでヒト免疫免システムの分化過程を解明した。本研究より得られた組織横断型データより、妊娠中期における骨髄系細胞およびリンパ球系細胞の機能獲得機構と末梢組織移入前の単球と T 細胞の詳細な成熟過程が明らかにされた。さらに筆者らは、ヒト血球系細胞分化の全体像や出生前 B1 細胞を特徴づけるとともに非典型的 T 細胞の起源を示した。これら大規模なヒト免疫細胞のデータは、生物学的に重要なもたらすリソースとして活用でき、生体内細胞工学や再生医療、先天性疾患の治療に役立つと考えられる。

POINT!

骨の成長には、血管新生作用が強く骨芽細胞の分化を促進する H 型血管が、重要な役割を持つ。この H 型血管は、成長期が終わると骨成長を促進する能力を持たない L 型血管に分化するが、 L 型血管へ分化を誘導する機序は不明であった。筆者らは若年マウスを解析し生後 5.5-6 週の時期に骨芽細胞由来の DMP1 が骨化前線から成長板に至る範囲で分布していることを発見した。次に DMP1 ^f/f Col1-CreERT2 (Dmp1^iΔOB) マウスを用いて、骨芽細胞特異的に成長期の DMP1 を欠損させたところ、 H 型血管が増加することを見出した。この Dmp1 ^iΔOB マウスでは VEGFR2 のリン酸化が促進していることを示した。さらに筆者らは in vitro で DMP1 が内皮細胞の VEGF シグナルを阻害することを確認した。また DMP1 の分泌は体重および FAM20C （分泌型リン酸化酵素の主要キナーゼ）と正の相関があることを示した。骨に荷重もしくは免荷する実験系を用いて、機械的な負荷が FAM20C と DMP １の発現を増加させることを示した。 DMP １発現細胞特異的 PIEZO １欠損マウス（ Dmp1 -Cre Piezo1^fl/fl ）では FAM20C および DMP １の発現が有意に低下したことから、機械的受容器 PIEZO1 が必須であることが判明した。以上の結果から筆者らは、思春期末期の体重増加に伴う機械的負荷が、骨芽細胞の機械受容器 PIEZO1 を作動させ、 FAM20C の産生および DMP １の分泌を促進することで H 型血管から L 型血管への分化を誘導していると結論づけた。

POINT!

歯周病が心血管疾患や関節リウマチなど種々の炎症性疾患のリスク因子になることは多くの研究により明らかにされている。本研究では、歯周病と関節リウマチが骨髄造血の変調を引き起こすことで、双方向的に病態を増悪させる可能性を示した。まず著者らは、マウスの大臼歯に絹糸を結紮することで誘導する実験的歯周炎（ LIP ）が、骨髄中の造血幹細胞において顆粒球分化に関連する遺伝子群の発現を上昇させ、ミエロイド系前駆細胞の数を増加させることを示した。マウス大臼歯から結紮糸を除去したマウス（ LIP-trained ）では、歯周病が治癒し顆粒球造血も定常レベルに戻る一方、歯周病誘導歴のないマウスと比較して LPS 投与後の顆粒球分化とミエロイド系細胞の炎症性サイトカイン産生が亢進した。 LIP-trained マウス由来骨髄細胞を用いたシングルセル ATAC-Seq 解析により、上記現象の原因がクロマチン変化を伴うエピジェネティックな変調であり、炎症刺激が除去された後も一定期間持続することが示された。さらに著者らは、歯周病によって“訓練”された骨髄細胞を移植したマウスはコラーゲン抗体誘発関節炎（ CAIA ）が悪化すること、逆に CAIA の誘導によって“訓練”された骨髄細胞を移植したマウスでは歯周病が悪化することを示した。分子メカニズムとしては、 LIP を誘導したマウスでは血中 G-CSF 濃度が上昇しており、これが好中球による IL-1 β産生を誘導し、造血幹細胞を刺激することで、骨髄訓練の変調を引き起こす可能性を示した。以上より、骨髄造血の変調がさまざまな炎症性疾患同士の連関を担う統一基盤の一つであり、有効な治療標的となりうることが示唆された。

POINT!

骨髄異形成症候群（ MDS ）は、造血幹細胞（ HSPC ）の異常なクローン性増殖による末梢の血球減少や造血前駆細胞の異形成、急性骨髄性白血病への移行を特徴とする疾患群である。 MDS 細胞はあまり増殖能が高くないにもかかわらず、正常な造血幹細胞を阻害し骨髄腔を占拠することが知られているが、どのようなメカニズムが関与しているかは不明であった。著者らは Abcg2 を過剰発現させた骨髄細胞を二次移植することにより MDS/AML 様の病態を示すマウスモデル (MDS/AML マウス ) を樹立し、 recipient の骨髄細胞を調べたところ、 HSPC の colony 形成能の低下およびアポトーシスの増加が見られた。しかし、 MDS/AML マウスの骨髄細胞と野生型 HSPC の共培養により、 MDS 細胞は直接 HSPC を阻害しているわけではないことがわかった。 MDS/AML マウスでは組織学的に骨の菲薄化が認められ、大腿骨の骨量が減少し、骨形成の低下が認められたことから、著者らは MDS 細胞が骨芽細胞系に影響を与えている可能性を考え、 MDS/AML マウス骨髄中の CD45^–TER119^–CD31^–CD140a⁺CD51⁺ 細胞を scRNA-seq で解析した。その結果、 MDS/AML マウスの間葉系幹細胞 (MSC) はコントロールの MSC と遺伝子発現に差があり、骨芽細胞系への分化マーカーの発現が低下していることが示された。また、 MDS/AML マウス由来 MSC を野生型 HSPC と共培養したところ HSPC の colony 形成が抑制され、骨芽細胞分化誘導培地で培養すると HSPC に対する抑制効果が打ち消された。すなわち、 MDS/AML マウスでは MSC の骨芽細胞への分化が抑制され、その結果 HSPC の維持が阻害されていると考えられた。著者らは MDS 細胞由来の細胞外分泌小胞 (EVs) に着目し、 in vitro で MDS/AML マウス骨髄細胞由来 EVs を野生型 MSC に添加したところ、骨芽細胞分化が抑制されることを見出した。さらに MSC と HSPC の共培養系に EVs を添加すると、 HSPC の colony 形成が低下した。続いて、 EVs に含まれる miRNA を miRNA microarray で解析し、 MDS/AML マウス骨髄細胞由来 EVs では骨芽細胞分化や生存・増殖に関わるシグナルを抑制する miRNA が多く含まれていることを見出した。最後に、 MDS 患者の血清と健常者の血清に含まれる miRNA を miRNA-seq で解析したところ、マウスと同様に、骨芽細胞分化や生存・増殖に関わるシグナルを抑制する miRNA が多く含まれていた。

以上の結果により、 MDS 細胞由来の EVs が MSC の骨芽細胞系への分化を抑制し、正常な HSPC の維持を阻害している可能性が示された。 EVs に含まれる他の因子の関与や MSC 以外の骨髄ニッチ構成細胞の関与などは否定できないが、今後の更なる研究により EVs による MDS 病態の制御機構が詳細に解明されることが期待される。

POINT!

火傷をはじめとした皮膚損傷は、その損傷の深さが浅い場合、分層植皮 (split-tickness skin grafting: STSG) と呼ばれる皮膚の上層のみの移植によって治療をすることができる。しかしこの治療では移植後に異常な色素の沈着や皮膚の拘縮を引き起こし、繰り返しの皮膚移植が必要になってしまうことも少なくない。近年、マウスを用いた実験によって皮膚損傷後の繊維性瘢痕形成に機械刺激が関与していることが明らかにされてきているが、シグナルの詳細な解析までは進んでいない。加えてマウスは皮膚の柔らかい動物であるため、ヒトの STSG 部位でみられるような拘縮が起きにくく、モデルの妥当性にも議論があった。

本論文で筆者らは、ヒトに近い皮膚をもつブタをモデル動物として STSG を行い、生じる瘢痕組織のシングルセル RNA シーケンス解析を行なった。その結果、正常皮膚に比べ STSG の線維芽細胞では炎症シグナル、機械刺激シグナルが亢進していることを見出し、そのシグナルに関わる FAK (focal adhesion kinase) の阻害剤を添加することで皮膚の拘縮を抑えることに成功した。

続けて筆者らは、拘縮抑制の詳細なメカニズムの解析を行うため、 FAK 阻害剤を塗布した STSG 部位についてもシングルセル RNA シーケンス解析を行った。その結果、移植 7 日後のミエロイド細胞における炎症シグナルの亢進が阻害剤の添加で抑えられていること、 90 日後の線維芽細胞では、阻害剤の添加によって繊維化に特徴的な遺伝子発現が抑制され、再生や脂肪形成に重要な遺伝子群の発現が上昇することを見出した。また、ハイドロゲル上でヒトの皮膚細胞を力をかけながら培養したところ、阻害剤の添加で同様の遺伝子発現変化が起きることを確認し、このメカニズムがヒトでも維持されている可能性を示した。

POINT!

関節リウマチなどいくつかの疾患では炎症が両側性に発生し、それには神経が関与すると考えられている。著者らは、 F759マウスの IL-17Aと IL-6を関節腔注射することで関節炎を発症するモデル (Murakami, J. Exp. Med., 2011) を用いてこのメカニズムを解析した。両側踵関節にサイトカインを注射し、第 5腰椎 (L5) レベルで片側後根神経節 (DRG) 近傍で求心路遮断を行ったところ、両側とも関節炎スコアが低下し、感覚神経を介した炎症の伝播が示された。片側のみの踵関節にサイトカインを注射したところ、同側の L5および反対側の L4-6で神経細胞の活性化が認められた。関節に神経線維のトレーサーを注射したところ、 L5 DRGの Nav1.8⁺TRPV1^-感覚神経が標識されたことから、炎症部を支配する感覚神経が炎症の伝播に関わることがわかった。 Herpes simplex virus 2 (HSV2) により、神経伝道路を解析したところ、注射側の踵関節から L5 DRG、 L5脊髄後角、第 13胸髄 (T13) を経て反対側の T10-13、 L4-6の DRGへと投射された。 T9-13で長軸方向に脊髄を切断したところ、サイトカイン投与に伴う反対側の L5 DRG神経細胞の活性化が見られなくなり、介在ニューロンの関与が示された。この経路に関わる介在ニューロンは proenkephalin陽性細胞であることがわかった。さらに、この神経回路に関係する神経伝達物質の探索をおこない、注射側の反対側で感覚神経における ATP産生増加を認めた。この ATP増加は求心路遮断や介在ニューロンの切断によって消失したことから、 ATPが炎症の拡延に関与することが示された。 ATP受容体 P2RX7は感覚神経だけでなく間葉系細胞や内皮細胞でも発現を認め、関節炎発症に伴い間葉系細胞や内皮細胞で CREBリン酸化が亢進したことからこれらの細胞が関節炎の拡延に際して細胞外 ATPに応答すると考えられた。関節リウマチの古典的モデルである CIAマウスにおいても上記と同様な経路の存在が確認された。以上より、片側の関節炎は感覚神経と介在ニューロンにより反対側に拡延すること、その経路には ATPが関与することが示された。

POINT!

心筋梗塞 (MI) の予後は血行の回復に依存することから、血管新生の誘導が治療戦略のキーとして注目されている。著者らは血管内皮細胞 (EC) を被覆する血管周皮細胞 (PC) に着目した。ヒト成人の心臓の冠動脈には CD31^–CD34⁺PDGFRβ⁺α-smooth muscle actin (αSMA)^– PCが存在する。これらの細胞は HGF、 angiopoietin-1/2、 VEGFなどの血管新生因子を産生することが見出された。 PCと ECを共培養したところ、長い管腔様構造を形成した。 PCは EGFと FGF2を含まない培地で培養することで血管平滑筋 (VSMC) に分化した。得られた VSMCでは endothelin刺激によるカルシウムシグナルや細胞収縮が増強された。また、ヒト冠動脈平滑筋細胞と同様にエラスチン (ELN) を高いレベルで発現した。 PCから VSMCへの分化メカニズムを解明するために、 EGFや FGF2で誘導されるシグナルを解析した。これらのサイトカインシグナルの下流では、 ERK1/2シグナルが活性化された。 PCの VSMC分化系に MEK阻害剤の PD0325901を添加したところ、 EGFおよび FGF2不含培地で培養した時と同様の効果が得られた。遺伝子発現の網羅的解析により、この阻害剤を添加することで、 MAPKシグナル遺伝子群の発現低下を伴う血管平滑筋収縮に関わる遺伝子群の上昇が見出された。 VSMCは PCと比較して ANGPT2、 TIE1、 SERPINEF1といった抗血管新生作用を有する遺伝子の減少を認めた。 PD0325901 をマウスに投与したところ、心筋への有害作用なく冠動脈の血管新生が促進され、心収縮能の向上が認められた。以上より、 MEKシグナルの阻害が心筋梗塞治療の新たな治療戦略の核となることが示唆される。

POINT!

慢性皮膚炎では、 TNFαなどのサイトカインの過剰産生によって上皮細胞の細胞死が誘導される。直鎖状ユビキチン鎖合成酵素複合体 LUBACの構成要素である Sharpinに cpdm型変異のあるマウスは、 TNF依存的に重度の皮膚炎を発症する。 TNFαの産生源についての検討から、好酸球とリンパ球ではないことが分かっている。著者らは Sharpin ^cpdmマウスの皮膚炎病巣でマクロファージや樹状細胞 (DC)、特にランゲルハンス細胞 (LC) が増加することに着目した。 Cd11b、 Ccr2、 Cd11c、ランゲリン (Cd207) プロモーターによりこれらの細胞でジフテリア毒素受容体 (DTR) を発現するマウスを Sharpin ^cpdmマウスと交配、ジフテリア毒素 (DT) 投与により、目的の細胞を欠損する皮膚炎マウスを作出した。その結果、 DCや LCが欠失する条件では皮膚炎の緩和が認められた。さらに、最近開発された CD11c発現細胞特異的に Suz12を欠損することにより LCが生後間もなく消失するマウス (Zhan, Sci. Immunol., 2021)を Sharpin ^cpdmマウスと交配することにより、皮膚炎における LC機能の解析を行った。このマウスでは、皮膚炎の全身への影響が低減し、皮膚局所の炎症は劇的に抑制された。 Sharpin ^cpdmマウス骨髄細胞を移入した Sharpin ^cpdm Cd207– DTRマウスでは皮膚炎が発症した一方、 Sharpin ^cpdm Tnfa ^–/–マウス骨髄細胞の移入では皮膚炎が抑制されたことから、 Sharpinの機能不全 LCは実験的皮膚炎マウスモデルにおける TNFαの産生源であると考えられた。

POINT!

脳脊髄液（ CSF ）は脳細胞の直接的な環境を構成し、栄養となる物質を供給している。本研究で著者らは、若齢マウス由来 CSF （ YM-CSF ）を老齢マウス脳に 1 週間、浸透圧ポンプを用いて持続的に直接注入すると、記憶能が向上することを発見した。海馬は加齢に伴う認知機能低下の中心であり、 CSF と密接な関係にあることから海馬の RNA-seq 解析を行ったところ、 YM-CSF を注入した海馬で最も反応するのはオリゴデンドロサイトであることが明らかになった。海馬 CA1 領域では YM-CSF 注入によりオリゴデンドロサイト前駆細胞（ OPC ）の増殖が促進され、この現象は健常若齢ヒト由来 CSF （ YH-CSF ）を注入したマウスでも同様に観察された。さらに、 YH-CSF は初代 OPC 培養において、細胞増殖と分化を促進することを明らかにした。 OPC の初代培養系において SLAMseq 法により新生 mRNA を代謝的に標識して解析したところ、 YH-CSF 処理後 1 時間でアクチン細胞骨格系の遺伝子発現に関わる転写因子である血清応答因子（ SRF ）が、最も高く誘導されることを見出した。実際に YH-CSF 処理後 6 時間で発現変化を示した遺伝子の多くが SRF の既知の標的遺伝子であり、 SRF とアクチン細胞骨格の調節が in vivo での若齢 CSF 注入効果のメディエーターであることを突き止めた。また、海馬 OPC では加齢に伴い SRF の発現が減少し、 YM-CSF の注入により SRF の転写標的遺伝子発現が活性化することも示された。著者らは、いくつかの SRF 標的遺伝子にポジティブフィードバック機構があることに着目し、利用可能なデータセットと転写因子結合予測から 35 の SRF 誘導因子候補に絞り込みを行いレポーター細胞で SRF 活性化因子をスクリーニングしたところ、 Fgf8 と Fgf17 が最も強い誘導活性を示した。著者らは脳に多く発現し、ヒト CSF では加齢に伴いその発現量が低下する Fgf17 に着目した。実際、 Fgf17 の老齢マウス脳への注入により OPC の細胞増殖や分化、長期記憶の定着が誘導された一方、抗 Fgf17 ブロッキング抗体を若齢マウス脳室内に注入すると認知機能が低下することが示された。これらの知見から、 Fgf17 が老化した脳のオリゴデンドロサイト機能を回復させる重要な標的であることが明らかにされた。

POINT!

CSF-1/M-CSF はミエロイド系細胞の維持に重要な役割を担っている。しかし、 CSF-1 の先天性全身欠損（ Csf1 ^op/op ）は大理石骨病を引き起こし、間接的に造血に影響を及ぼす可能性がある。マウス骨髄の血管、血管周囲、骨芽細胞ポピュレーションを含む 2 つのシングルセル RNA-seq データセットを解析したところ、血管周囲の間質細胞、内皮細胞、骨芽細胞が Csf1 の主要な供給源であることが確認された。単球を維持する機能的に重要な CSF-1 の供給源を明らかにするために、骨髄の主要な Csf1 供給源である骨芽細胞系列細胞および間葉系間質細胞（ MSC ）の Csf1 を欠失させた。 Osx1 -Cre; Csf1^fl/fl マウスでドキシサイクリンを投与せずに発生段階から Csf1 を欠損させた場合、 Csf1 ^op/op と同様の骨と血球系の表現型を示した一方、 8 週齢までドキシサイクリンを投与し、その後 Csf1 を欠損させた場合では、骨芽細胞および骨細胞、骨髄 Lepr⁺ MSC において Csf1 発現は約 70% 減少したが、骨髄、血液中の造血幹 / 前駆細胞（ HSPC ）や単球、リンパ球などには影響を及ぼさなかった。 Lepr -Cre; Csf1^fl/fl マウスでは、 PDGFR 発現 MSC で Csf1 欠損が誘導されたが、血液、脾臓、骨髄での白血球には影響が観察されなかった。同様に、 Pdgfrb -CreERT2; Csf1^fl/fl 、 Nes -CreERT2; Csf1^fl/fl マウス、 Lepr -Cre; Nes-CreERT2; Csf1^fl/fl および Dmp1 -CreERT2; Csf1^fl/fl マウスでも骨髄における単球に変化はみられなかった。一方、 8 週齢の Ubc -CreERT2; Csf1^fl/fl マウスにタモキシフェン含有食を与えることで Csf1 を誘導性に全身で欠失させると、骨髄の単球系細胞の生存や分化、遊走、末梢のマクロファージ数などが低下した。骨の組織学的解析により単球の局在を詳細に調べたところ、類洞内皮細胞や Lepr 陽性の血管周囲 MSC の近くに存在することが明らかになった。実際、 Cdh5 -CreERT2; Csf1^fl/fl マウスでは骨髄の Ly6C^int と Ly6C^– 単球が選択的に減少しており、内皮細胞由来の CSF-1 が Ly6C^– 細胞の生存を直接的に維持していることが示唆された。内皮細胞特異的 Csf1 欠損は、脾臓や血中の Ly6C^– 単球も減少させ、内皮細胞由来の CSF-1 が Ly6C^hi → Ly6C^– 分化を制御することが示された。 Lepr -Cre; Cdh5-CreERT2; Csf1^fl/fl マウスで Lepr⁺ MSC と内皮細胞で Csf1 を欠損させると、骨髄や血中の Ly6C^hi 、 Ly6C^int 、 Ly6C^– 単球が減少した。以上のデータから、成体骨髄において内皮細胞由来の CSF-1 が Ly6C^– 単球の維持に重要である一方、内皮細胞と Lepr⁺ MSC は Ly6C^hi 単球の維持に必要な CSF-1 の供給源であることが示唆された。さらに、 Bmx -CreERT2 を用いて Csf1 を動脈内皮細胞特異的に欠失させたマウスでは単球の数に影響を与えなかったことから、類洞内皮細胞が Ly6C^– 単球を維持するための機能的に重要な CSF-1 の供給源であることが明らかになった。また、内皮細胞特異的 Csf1 欠損マウスに腸管穿孔による腹膜炎を誘導したところ、敗血症生存率は同様であったが、体重減少が促進され、血中および骨髄における Ly6C^– 単球の回復が阻害された。以上の結果から、 Ly6C^– 単球が類洞内皮細胞の産生する CSF-1 によって維持され、 Ly6C^hi 単球は内皮細胞と Lepr⁺ MSC の両方が産生する CSF-1 を必要ととする一方、骨芽細胞系列細胞由来の CSF-1 は単球の維持には重要でないことが明らかになった。

POINT!

老化細胞（ SC ）は細胞老化関連分泌形質により炎症性サイトカインなどを産生し、隣接する細胞や SC 自身の機能に影響を与える。高齢者では一般的に骨折治癒が遅延するが、間葉系前駆細胞（ MPC ）の減少がその一因と考えられてきた。しかしながら、高齢者の骨折治癒に対する細胞老化の寄与については、まだ十分に研究されてはいなかった。本研究で著者らは、 4 ヶ月齢の若齢マウスと 20 ヶ月齢の高齢マウスを用いて骨折を誘導したところ、仮骨において若齢・老齢どちらでも老化マーカーの p16 、 p21 、 SA–β-gal および γ-H2AX の発現が増加することを見出した。すなわち、骨折後の仮骨において SC が急速に増加していることが明らかになった。 SC の抑制が骨折治癒を促進するかどうかを調べるため、老化細胞除去薬であるダサチニブとケルセチン（ D+Q ）を若齢および老齢マウス骨折後 1 、 3 、 5 、 7 日目に投与した。これにより、老齢マウスでのみ新生骨面積や骨強度が上昇することが確認された。老齢仮骨細胞馴化培地は若齢と比較して仮骨由来 MPC （ CaMPC ）の増殖を阻害し、 D+Q によって抑制された。老齢仮骨 SC で発現している SASP 因子を qPCR により調べたところ、検討した 21 の SASP 因子のうち特に Tgfb1 が老齢仮骨の SASP 因子として最も高い発現量を示し、仮骨中の p16⁺TGF-β1⁺ 細胞数は若齢と比較して 25 倍多かった。また、仮骨の TGF-β1 タンパク質量は D+Q 投与により著明に低下した。著者らは、老齢マウス仮骨中の SC が過剰な TGF-β1 を産生し、仮骨 MPC の増殖を阻害して骨折の治癒を遅らせるのではないかと考え、 TGF-β 中和抗体を老齢マウス骨折後 1 、 3 、 5 、 7 日目の仮骨内に投与した。 TGF-β 中和抗体により、コントロールと比較して仮骨体積、軟骨・新生骨面積および骨強度が上昇し、仮骨中の CD45^–CD31^–CD105⁺ MPC および Ki67⁺ 増殖細胞の割合と数が有意に増加した。以上から、骨折は老齢マウスの仮骨において著しい細胞老化を引き起こし、 TGF-β1 を発現することで MPC を抑制することが明らかになり、老化細胞除去剤や TGF-β 中和抗体は高齢者の高齢者の骨折修復を促進する治療法として使用できる可能性が示された。

POINT!

IL-17は固形腫瘍の予後不良に関連する因子の一つである。IL-17は、組織再生過程などでは炎症を惹起する。近年、腫瘍の微小環境ではこのサイトカインが免疫抑制的に作用することが明らかになった。皮膚腫瘍形成モデルのDMBA/TPA塗布マウスでは、腫瘍細胞は主に腫瘍関連線維芽細胞 (CAF) が形成する間質に被包される。著者らがこの腫瘍間質の解析を行ったところ、中にIL-17産生細胞が認められた。そこで、Il17rc^f/fCol1a2^CreERT2マウスに腫瘍を誘導した後にタモキシフェンを投与し、腫瘍におけるIL-17の意義を検討した。このマウスの腫瘍中では線維形成が減少し、抗PD-L1抗体への感受性が増加した。また、腫瘍内部へのグランザイムB⁺CD8⁺T細胞の浸潤は亢進していた。Il17rc^f/fCol1a2^CreERT2マウスのCD8⁺T細胞を中和抗体で除去すると、抗PD-L1抗体による治療効果は消失した。Il17rc^f/fCol1a2^CreERT2マウスに形成された腫瘍の解析の結果からHIF1αの発現低下に着目した。IL-17によるCAF刺激はAct1を介してHIF1αタンパク質を増加させた。Hif1aのmRNAにはAct1結合領域が存在し、これらの結合によりHIF1αタンパク質の翻訳が促進されることが示された。Hif1aアプタマーを作出し、腫瘍モデルマウスに投与したところ、アプタマー単独での腫瘍抑制効果は限定的であったものの、抗PD-L1抗体と共に投与された場合は腫瘍の増大を強力に抑制した。以上より、腫瘍内のIL-17シグナルはHIF1αを介して腫瘍間質を成長させ、さらにCD8⁺T細胞の浸潤を阻害することで病態を悪化させることが示された。

POINT!

若年期に苦境におかれると、神経回路の発達に異常をきたし、青年期以降に異常なストレス反応を主徴とする精神・神経疾患を発症するリスクが高まる。しかし、若齢期のストレス環境 (ELA) が神経回路形成を制御するメカニズムは不明である。著者らは、新生仔マウスを巣材の少ない環境で飼育することによってストレスに晒した。これにより、視床下部室傍核の副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH)⁺細胞において興奮性シナプス (vGlut2⁺シナプス) が増加し、自発的な活動電位の発生が認められた。二光子顕微鏡を用いてシナプス刈り込みを行う細胞であるミクログリアを解析したところ、CRH⁺ニューロン近傍のミクログリア数はELAにより変化しなかったが、細胞突起の長さや運動性が低減した。電子顕微鏡観察により、ELAマウスではシナプスの貪食が減少することが明らかになった。このELAに伴う貪食像の減少はCRH⁺ニューロン特異的なイベントであった。次に、ミクログリアの貪食制御機構を検討した。貪食作用にはAxlやMerといった受容体型チロシンキナーゼが関与する。Ex vivoの実験でMer阻害剤UNC2025を加えた際、対照群の脳組織ではCRH⁺ニューロンの興奮性シナプスが増加した一方、ELAマウスの脳組織ではそのような増加は見られなかった。この結果から、ELAマウスの脳組織ではMer活性が既に低下していたためと考えられた。ELAマウスのミクログリアをGq-designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) 法により活性化すると、CRH⁺ニューロンの興奮性シナプスは減少した。ELAでは、副腎の重量が増すことがわかっているが、Gq-DREADD法によるミクログリアの活性化は、副腎重量増加を打ち消した。また、ELAマウスでは、成熟後もストレス反応が大きいが、Gq-DREADD法によりミクログリアを活性化することによって対照群と同等レベルに低減された。以上より、若齢期のストレス刺激はミクログリアの活性を抑制し、視床下部-副腎皮質系を活性化することで成熟後にも以上なストレス反応を引き起こすことが明らかになった。

POINT!

真菌は腸内微生物叢の重要な構成要素の一つであるとされているが、分布や機能には不明な点が多い。本研究で著者らは、まず、消化管の部位ごとに管腔中の常在真菌 (LUM) と粘膜に定着している真菌 (MAF) の解析をおこなった。胃、空腸、回腸、盲腸、結腸のいずれの部位でもLUMとMAFの構成は異なり、MAFの方が多様性に富んでいた。LUMには一過性と思われる菌種が多く、MAFには免疫原性の種、Candida、Saccharomyces、Saccharomycopsisなどが多く認められ、腸管内で特定の免疫応答を誘導する菌種が腸管内に定着できると考えられた。DSS腸炎マウスにLUMまたはMAFを植菌したところ、LUMではマウスの致死率が改善しなかった一方でMAFでは改善が見られた。MAFを植菌したマウス (MUCマウス) の腸管上皮細胞では、免疫応答と細胞増殖に関わる遺伝子群が大きな変動を示し、バリア機能が向上することが確認された。MUCマウスの腸管粘膜固有層と腸間膜リンパ節ではTh17細胞が増加していた。このマウスのTh細胞ではIL-17A、IL-17F、IL-22の産生が増加していた。ILC3の数やサイトカイン産生には変化は見られなかった。これらの関与を確認するために、Il17a^–/–マウスとIl22^–/–マウスにDSSモデルとMAFの植菌を行なったところ、前者では対照群よりも生存率が微増した一方、後者では植菌によるバリア機能や生存率の上昇効果が認められなかった。IL-22産生Th17細胞のバリア機能への寄与を検証するために、Rag1^–/–マウスにIl22^+/–またはIl22^–/–マウスのCD4⁺細胞を移入し、DSSモデルとMAFの植菌を行った。その結果、前者のマウスにおいて生存率が上昇したことから、これらの細胞の重要性が示唆された。著者らはこれらの真菌が感染防御に役立つかを検討した。MUCマウスではC. rodentium感染症が軽度であった。Il22^–/–マウスで同様の感染実験をした場合はC. rodentiumの腸管への定着が多く感染症がより重度であった。腸管免疫と脳機能に相関があるという報告が近年あいついでなされていることから、MUCマウスの行動解析を行った。その結果、これらのマウスでは社会性が向上することが見出された。中枢神経系においてIL-17受容体は高いレベルで発現する一方、IL-22受容体の発現は高度ではなかった。MUCによる社会性の向上はIl22^–/–マウスでも認められたが、神経特異的IL-17受容体欠損マウス (Il17ra^f/fBAF53b-Creマウス) では認められなかった。以上より、腸内真菌叢は、IL-22を介してバリア機能を、IL-17を介して社会性を向上させることが示された。

POINT!

高齢の女性ではアルツハイマー病（AD）の発症率が高く、認知機能は閉経移行期における内臓肥満蓄積やエネルギー代謝異常、骨量低下に伴って急激に悪化する。著者らは以前、抗体により卵胞刺激ホルモン（FSH）を阻害すると熱産生が促進され血清コレステロール値が低下して体脂肪が減少し、骨量が増加することを示した。本研究で著者らは、FSHがマウスの海馬や大脳皮質などの領域で神経細胞のFSH受容体に作用し、ADの特徴を引き起こすことを明らかにした。3種類のマウスモデル（Psen1^M146Vノックイン変異とヒトAPP^K670N/M671LおよびヒトMAPT^P301Lのトランスジーンをホモ接合性に有する3xTgマウス、APP^K670N/M671LとPSEN1^DE9からなるヒトのトランスジーンを持つAPP/PS1マウスおよびApp遺伝子に3つの変異（G601R、F606Y、R609H）がノックインされ、オリゴマー化しうるAβが発現するAPP-KIマウス）を用い、卵巣摘出やFSHリガンド投与によってADの特徴であるアミロイドβやタウの沈着、ニューロンのアポトーシス、認知機能低下などが誘導され、抗FSH抗体投与やAAV2-siFshrの定位注入による海馬選択的なFSH受容体発現抑制によってそれらの表現型が抑制されることを証明した。また、卵巣摘出は海馬ニューロンにおいて転写因子C/EBPβの発現を強く誘導し、それによりアミロイド前駆体タンパク質（APP）を切断してアミロイドβを生成し、タウを切断して神経原線維変化を生じさせる酵素であるδ-セクレターゼであるアルギニンエンドペプチダーゼ（AEP）を活性化した。FSH抗体投与などによってFSHを阻害すると、卵巣摘出モデルマウスにおけるC/EBPβ-AEP/δセクレターゼ経路の活性化、APPとタウの切断、タウのリン酸化の増加が顕著に減少することが示された。以上の結果から、閉経期におけるADの増悪に血中FSHレベルの上昇が関与していることが示唆され、AD、肥満、骨粗鬆症、脂質異常症のすべてをFSH阻害剤で治療できる可能性が明らかにされた。

POINT!

肝性骨異栄養症（HOD）は、原発性胆汁性肝硬変や原発性硬化性胆管炎などの慢性肝疾患に伴う代謝性骨疾患で、HOD患者の約75％が骨量減少をきたすことから、肝臓から骨への作用が示唆されているが、その詳しい分子機構は不明であった。HODの原因となるメカニズムを特定するために、著者らは質量分析法を用いてHODを伴う肝硬変患者と骨密度が正常な患者から得た肝臓組織で発現量を比較したところ、肝疾患の進行によりホスファターゼであるPP2Acのα触媒サブユニットの発現と活性が上昇することを見いだした。そこで、肝臓特異的PP2Acα欠損マウスを作製し、四塩化炭素（CCl₄）投与による肝障害を誘発させたところ、PP2Acα欠損によりCCl₄誘発性肝損傷に伴う骨形成低下および骨吸収上昇が抑制されることによって骨量が維持されることが明らかになった。肝損傷PP2Acα cKOマウスから血清を採取し、プロテオミクス解析により肝損傷によって発現変動する122のタンパク質が同定された。さらに、様々な観点から4つのタンパク質に絞られ、そのうちの1つであるレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）だけが肝臓由来であった。LCATはコレステロールを末梢組織から肝臓に戻す役割を担っているヘパトカインである。PP2Acα cKOマウスの骨量低下を防ぐためにLCATが必要かどうかをさらに調べるため、CCl₄投与前にPP2Acα cKOマウスに肝臓を標的とするrAAV8-shLcatを注入したところ、コントロールマウスと同程度の骨量低下が観察された。すなわち、著者らのHODモデルにおいてPP2Acα欠損マウスのLCAT発現上昇が骨量低下の緩和に寄与していることが明らかとなった。実際にHOD患者の血清LCAT量と大腿骨頚部BMDの相関を調べたところ、血清LCAT量は大腿骨頚部BMDと正の相関を持つことが示唆された。また、リコンビナントLCATは骨芽細胞分化を促進し、破骨細胞分化を抑制する活性を示し、コレステロールを培地中に加えるとこの効果がキャンセルされた。以上の結果から、LCAT はコレステロール依存的に破骨細胞・骨芽細胞分化を制御することが示唆された。さらに、LCATによって骨組織から輸送されたコレステロールが損傷後の肝臓回復に関わることも明らかにされた。以上から、HODではPP2Acαの発現上昇によってLCATの発現低下が誘導されることで骨量減少や肝障害が進行することが示され、この経路を標的とすることで疾患の進行を改善できる可能性が示された。

POINT!

骨におけるコリン作動性シグナルの役割はほとんどわかっていなかった。交感神経と副交感神経は通常、神経伝達物質としてノルエピネフリンとアセチルコリン（ACh）をそれぞれ使用する。しかし、一部の胚性交感神経ニューロンはコリン作動性の特徴を示すが、その頻度は徐々に減少し、出生までに交感神経細胞の約4%になる。このような初期のコリン作動性交感神経ニューロンが、出生後にコリン作動性になる交感神経ニューロンと重なるかどうかは不明であった。この交感神経ニューロンの「コリン作動性スイッチ」は、マウスでは生後数週間の間に起こる。さらに、骨に対するコリン作動性神経線維の役割はほとんど不明であった。Neurturin（NRTN）のGDNFファミリー受容体α2（GFRα2）への結合は、コリン作動性神経細胞の発達と生存を促進することが知られていることから、著者らはGFRα2欠損マウスをコリン作動性神経欠損のモデルとして使用した。コリン作動性線維の起源を明らかにするために、新生児マウスに6-ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）を投与し、生後のコリン作動性スイッチの前に交感神経線維を消失させた。これらのマウスの成体では、大腿骨と頭蓋骨でノルアドレナリン作動性線維とコリン作動性線維が同様に減少した。すなわち、骨のコリン作動性線維が交感神経系に由来することを示唆している。また、これまでの研究でIL-6ファミリーがコリン作動性遺伝子発現を促進することが示唆されていた。著者らはin vivoでのIL-6の産生源とコリン作動性スイッチを活性化する可能性を検討するため、生後3日目の四肢における近接ライゲーションアッセイを行ったところ、骨膜付近の主に隣接する骨格筋に高いIL-6発現がみとめられた。生後6週間IL-6阻害剤を投与したマウスやIl6^−/−マウスの大腿骨と頭蓋骨には、ノルアドレナリン作動性神経線維が正常に存在していた一方、コリン作動性神経線維が顕著に減少したことから、IL-6が生体内でコリン作動性スイッチを促進することが示唆された。また、骨芽細胞系列細胞は骨および骨髄においてコリン作動性神経シグナルを伝達し増幅している可能性も示された。さらに、Gfra2^−/−マウスでは特にメスの脛骨において、皮質骨量、皮質骨厚および骨梁厚などが減少し、3点曲げ試験での剛性と強度も低下していた。これらのマウスでは骨形成が低下した一方、骨吸収は変化していなかった。これらのマウスの骨細胞は、細胞形態の異常や樹状突起の減少、骨細胞数の減少に加え、Mmp14発現低下とSost発現上昇を示し、トレッドミル運動によるSost発現低下に抵抗性を示した。トレッドミル運動を行ったGfra2^−/−マウスのスクレロスチンを抗体により阻害すると、骨形成速度、骨強度、骨梁厚などが正常化したことから、Gfra2^−/−マウスの骨減少症におけるスクレロスチンの重要性が明らかにされた。近接ライゲーションアッセイにより、骨のコリン作動性神経線維で最も高いNRTN発現が観察されたことから、これらの神経線維は骨細胞でNRTNシグナルを活性化し、その欠如が生体内のGFRα2発現骨細胞の異常を引き起こす可能性が示唆された。実際、新生仔での6-OHDA投与でも成体の骨細胞数および樹状突起が減少し、これはNrtn^−/−マウスでも同様の表現型であったことから、NRTN-GFRα2シグナルが骨細胞の生存を促進していることが示唆された。次に著者らは、適度な運動によって骨髄のコリン作動性神経線維が顕著に増加し、海綿骨量などが上昇した一方、生後早期の交感神経遮断により運動に対する適応がキャンセルされることを示した。さらに、運動による交感神経コリン作動性活性がin vivoで骨芽細胞系列細胞に伝わるかどうかを検討したところ、運動したマウスではChATで標識される骨芽前駆細胞が増殖し、骨芽前駆細胞や骨細胞でACh濃度が増加したが、IL-6阻害したマウスではいずれも観察されなかった。適度な運動は野生型マウスの骨梁幅を上昇させたが、Gfra2^−/−マウスやIL-6阻害を行ったマウスではキャンセルされた。これらの結果は、IL-6が生後発育期のコリン作動性スイッチを駆動するだけでなく、身体活動に応じて骨格のコリン作動性調節を強化する役割を担っていることを示唆している。これらの結果から、コリン作動性神経と骨細胞の相互作用が、骨同化作用を通じて骨格形成とターンオーバーを制御していることが明らかになった。

POINT!

骨折治癒の初期〜中期において、損傷部位の周囲に線維軟骨と硝子軟骨から成るsoft callus (軟仮骨）が形成される。この時、mesenchymal progenitor cells (MPCs)が仮骨に集積・増殖し、骨軟骨細胞へ分化することにより骨折治癒が進行する。この研究では、仮骨中の老化細胞がMPCsの増殖を阻害し、骨折治癒を遅延させることを明らかにした。まず、4ヶ月齢の若齢マウスと20ヶ月齢の老齢マウスの骨折モデルにおいて、仮骨中の老化マーカーの変化をqPCRおよび組織染色にて解析し、老齢マウスでは損傷後3~14日の老化マーカーの発現が有意に上昇していることを見出した。そこで、骨折モデルにおいてダサチニブおよびケルセチン投与により老化細胞を除去すると、老齢マウスの骨折治癒が促進された。また、老齢マウス仮骨の培養上清をcallus-derived MPCs (CaMPCs)に添加したところ、CaMPCsの増殖が抑制された。筆者らは仮骨中のSASP (senescence-associated secretory phenotype)に注目し、仮骨に含まれるSASPをqPCRにて測定したところ、老齢マウスの仮骨ではTgfb1、Il1a、Cxcl1が高発現しており、仮骨の培養上清にTGF-β中和抗体を添加すると、CaMPCsの増殖が回復することも明らかになった。さらに、骨折モデルにおいて損傷後3~14日の仮骨ではTGF-β1が増加しており、TGF-β中和抗体の投与により骨折治癒が促進されることを見出した。これらの結果から、老齢マウスではcallus中の老化細胞から分泌されるTGF-β1により、MPCsの増殖が抑制されていると結論づけられた。老化細胞を標的としたsenolytic drugs (老化細胞死誘導薬)は以前から注目されているが、細胞除去ではなく細胞による効果を減弱する効果ももたらすことがわかった。特に本研究においては高齢者の骨折修復の新たな標的として、TGF-β1シグナルが有効である可能性が示された。

POINT!

骨髄間葉系幹細胞（BMSCs）の脂肪細胞分化は、加齢や更年期による骨髄の脂肪化や骨粗鬆症に寄与している。また、血管石灰化は骨粗鬆症に伴って発症することが多く、その病態形成機序には骨形成との類似点も多いことが指摘されている。このように、骨と血管とのあいだでミネラル化が相反する現象は「石灰化パラドックス」と呼ばれているが、その詳細なメカニズムは不明であった。著者らは、まず、高齢者および若年者から単離した骨基質由来細胞外小胞（B-EV）の性状解析や、Dmp1^iCre ; Cd63^{em(loxp-mCherry-loxp-eGFP)3}マウスの骨および血管組織の解析から、B-EVの大部分は骨細胞由来であり、骨基質から血管に輸送されることを明らかにした。次に、BMSCおよび血管平滑筋細胞（VSMC）に、若齢マウス骨基質由来EV （YB-EVs）または老齢マウス骨基質由来EV（AB-EVs）を添加したところ、AB-EVsがBMSCに対しては脂肪形成を促進させ、血管平滑筋細胞に対しては石灰化形成を促進させることを明らかにした。マウスモデルを用いたin vivo実験では、AB-EV投与により骨形成が低下し骨髄の脂肪化が促進すること、ビタミンD3誘導性の血管石灰化が増悪することが示された。また、骨吸収阻害剤であるアレンドロン酸（ALE）を投与すると、AB-EVsの放出が抑制され、加齢や卵巣摘出による骨形成の低下や骨髄の脂肪化が改善することが明らかとなった。ビタミンD3を投与した老齢マウスでも、ALE投与によって、卵巣摘出術による血管石灰化が改善した。さらに、miRNAの網羅解析および機能解析により、AB-EVに濃縮されたmiR-483-5pとmiR-2861が、BMSCの脂肪細胞分化の促進、血管平滑筋細胞の石灰化の増悪にそれぞれ必須であることが明らかになった。最後に、miR-483-5pあるいはmiR-2861を阻害したAB-EVsを若齢マウスに移植することで、miR-483-5pが骨形成の低下および骨髄の脂肪化を促進させること、miR-2861が血管石灰化の増悪に関与させることが明らかになった。以上より、AB-EVを介した石灰化パラドックスの新たなメカニズムが解明された。

POINT!

骨のリモデリングは、骨を吸収する破骨細胞と骨を形成する骨芽細胞によって制御されている。骨吸収と骨形成は、断続的にカップリングを行うことで恒常性を保っている。骨吸収から骨形成への移行に関連する因子はこれまで報告されているが、骨形成期から骨吸収期へ転換する分子機序の全容は解明されていない。著者らは多光子顕微鏡を用いた高解像度の生体内イメージングを行うことにより、マウスの骨芽細胞はSOVs(small osteoblasts vesicles)と呼ばれる細胞外小胞を分泌し、取り込むことを発見した。In vitroにおける骨芽細胞のSOVs処理は骨芽細胞分化を抑制し、さらにRANKLの発現を増強することで、破骨細胞の分化を促進した。SOVsが骨芽細胞分化を抑制する機序を明らかにするために、筆者らは次世代miRNAシークエンス解析を行い、SOVsはmiR-143-3pを豊富に持つことを示した。さらにMC3T3E1細胞へのmiR-143-3pの移入は骨芽細胞の転写因子であるRunx2やSp7の発現を抑制した。また、著者らは公共データベース(TargetScan)を用いて解析することで、miR-143-3pの標的遺伝子として、Runx2やSp7の発現を制御しているCbfb（core-binding factor b）を同定した。以上のことから、SOVsを介した細胞間の相互作用は、骨代謝における骨形成期から骨吸収期への移行に影響を与える重要な因子と考えられる。

POINT!

自律神経は、交感神経と副交感神経を介して生体の機能を調整している。骨髄では、交感神経（アドレナリン作動性）は造血を促進するが、副交感神経（アセチルコリン作動性）と造血の関わりは不明であった。筆者らは、B細胞が副交感神経系の神経伝達物質であるアセチルコリンの重要な供給源であり、造血を抑制することを明らかにした。まず、アセチルコリン合成酵素choline acetyltransferase (Chat)を持つ骨髄細胞を調べると、ほぼB細胞であった。そこでB細胞特異的にChatを欠損したCd19^creChat^fl/flマウスを解析すると、B細胞のアセチルコリン分泌量が低下するとともに、白血球造血が上昇していた。次に、アセチルコリン受容体cholinergicα7 nicotinic receptor (Chrna7)を発現している細胞をシングルセルRNA-seqで検索すると、leptin receptor⁺ (LepR⁺)間質細胞などであり、間質細胞特異的にChrna7を欠損させたNestin^creChrna7^fl/flマウスは、Cd19^creChat^fl/flマウスと同様の所見が見られた。すなわち、B細胞由来のアセチルコリンが間質細胞に作用して造血を抑制していることが示された。さらに、動脈硬化や心筋梗塞などの心血管系疾患モデルでも、Cd19^creChat^fl/flマウスでは病変部の炎症性骨髄細胞が増加していた。加えて、心筋梗塞患者のコホートでは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤であるドネペジル服用群で梗塞後の白血球の増加が少ないこと、またマウスの心筋梗塞モデルでも、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤投与により炎症性骨髄細胞の増加が抑えられることから、アセチルコリンは定常時のみならず緊急時にも造血を抑制しており、このメカニズムの解明は新たな治療法につながりうると考えられた。

POINT!

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、次世代のがん治療法として注目され、2010年に実施された第一相試験において慢性リンパ性白血病(CLL)患者に対し投与された。筆者らは、CAR T細胞治療を受け、寛解に至ったCLL患者2名を対象として、末梢血におけるCAR T細胞および免疫細胞の量的・質的変動を10年に渡り調査した。CAR T細胞の投与後3年目以降、B細胞はほとんど検出されなかった。CAR T細胞は生体内で10年間維持されていた。長期間維持されるCAR-T細胞の大部分は活性化CD4 T細胞であり、高い増殖能と細胞障害活性を持つことが示唆された。CAR T細胞移入後早期では、CD8陽性CAR T細胞だけでなく、CARを発現するγδT細胞の一過的な増殖が認められた。これらの予期しないCAR-T細胞集団の変遷と細胞特性から白血病の長期寛解に関する重要な示唆が与えられた。

POINT!

　腫瘍細胞による微小環境のリモデリングは、がんの成長を促進する経路を活性化する。著者らはこれまでの研究で、セロトニンシグナル阻害による骨芽細胞数の維持がマウス白血病モデルにおける生存期間を延長させることを示していた。本研究では、マウスモデルや患者由来細胞の異種移植、急性骨髄性白血病（AML）や骨髄異形成症候群（MDS）患者サンプルを用いて、AMLが末梢のセロトニンシグナルを利用して、骨内膜ニッチを有利に再構築していることを明らかにした。

　間歇PTH投与による骨芽細胞増殖促進ではマウスAMLモデルにおける致死率を改善させることができず、骨芽細胞数ではなくセロトニン受容体シグナルの重要性が明らかとなったことから、骨芽細胞で発現するセロトニン受容体HTR1Bに着目した。Htr1b^–/–マウスや骨芽細胞特異的HTR1B欠損マウスではAMLモデルにおける病態進行が著明に改善した一方、選択的HTR1B受容体アンタゴニストSB224289投与では部分的な改善しかみとめられなかったことから、セロトニンとは異なるリガンドが骨芽細胞のHTR1B受容体に作用してAML進行に関わる可能性が示された。そこで著者らは、初代ヒト骨芽細胞とヒトAML細胞株の単独または共培養上清のメタボロームプロファイリングからキヌレニン（Kyn）を同定した。Kynはセロトニンと同様にトリプトファン（Trp）からIDO1などにより変換される。実際にMDSからAMLに進行した患者のそれぞれのステージおける骨髄中のKyn/Trp比や骨髄単核細胞でのIDO1発現はMDSからAMLへの疾患の重症度の進行に伴って上昇することが示された。また、KynはHTR1Bの部分アゴニストであり、HTR1Bシグナルを活性化できることも明らかにされた。さらに、白血病細胞においてIDO1を欠失させると、AMLモデルでの病態進行を著しく抑制し、血清Kynレベルを低下させ、生存期間を延長させた。さらに著者らは、AML細胞株と共培養したヒト初代骨芽細胞において単独培養と比較して発現が上昇した炎症性分子のうち、急性期タンパク質である血清アミロイドA1（SAA1）が、AML細胞株でのIDO1発現を上昇させることを同定した。Kyn刺激やAML細胞株共存培養はマウス骨芽細胞におけるSaa3（マウスSAA3はヒトSAA1のオルソログである）の発現を上昇させた一方、Htr1b^–/–骨芽細胞ではSaa3発現を変化させなかったことから、AML細胞から分泌されるKynがHTR1B依存的に骨芽細胞のSAA発現を上昇させることが示された。さらに、NSGマウスに患者由来AML細胞を移植するモデルに対し、シタラビン（Ara-C）単独、IDO1選択的競合阻害剤エパカドスタット単独、両薬剤併用を3週間行った。治療開始後22日目の評価では、Ara-C単独もしくはエパカドスタット単独投与マウスでは病態が進行していたが、併用療法はAML細胞数を有意に減少させた。すなわち、IDO1阻害はこのモデルにおいてAra-Cに対する反応を増強することがわかった。

　以上の結果から、白血病細胞は骨芽細胞におけるセロトニンシグナルを操作し、Kyn-HTR1B-SAA-IDO1シグナルを利用して、自己増殖性の炎症性ニッチを誘導することが明らかとなった。この結果は、ニッチを標的としたAMLに対する治療法として、がん治療の新しい道を開くことが期待される。

POINT!

　グルココルチコイド（GC）は多様な臓器での遺伝子発現を制御することにより、多くの生理的プロセスに影響を与える生体恒常性の重要な調節因子である。オステオカルシンはGCによって転写抑制されることが知られており、GCが骨に与える影響はよく知られているが、骨が副腎機能を調節することは知られていなかった。本研究で著者らは、少なくともマウスとサルにおいて骨と副腎は骨から副腎へのフィードフォワード活性化と副腎から骨へのフィードバック阻害からなる古典的な内分泌系を構成し、オステオカルシンが副腎ステロイド産生を促進することを明らかにした。

　成体マウスやアカゲザルにオステオカルシンを投与すると、副腎皮質ホルモンの血中濃度が急速に上昇したことから、副腎における遺伝子発現を調べたところ、副腎ステロイド生成酵素だけでなく副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）受容体をコードするMc2rやアンジオテンシンII受容体遺伝子の発現が上昇し、オステオカルシンがACTHとアンジオテンシンのシグナル伝達を促進している可能性が示唆された。副腎におけるオステオカルシン受容体発現をqPCRやRNAscopeにより調べたところ、Gprc6aではなくGpr158が皮質全体に発現していることが示された。実際に、副腎皮質細胞を含むSf1発現細胞特異的Gpr158欠損（Gpr158_Sf1^–/–）マウスでは副腎皮質ホルモンレベルが低下しており、オステオカルシンを投与してもレスキューされなかった。一方、Ocn^+/–母マウスから生まれたOcn^–/–マウスはコントロールと比較して副腎皮質ホルモン値に変化はなかったが、Ocn^–/–母マウスから生まれたOcn^–/–マウスは、8、24、52のいずれの週齢でも副腎皮質ホルモン量が低く、副腎におけるステロイド生成酵素の発現が減少していた。さまざまな実験結果から、著者らは胎生期のオステオカルシンへの曝露が出生後の副腎皮質ホルモン産生に影響を与えることを明らかにした。さらに、成体では副腎のホルモンレベルが低下しただけでなく、副腎ステロイドによって制御されている生理的機能も同時に阻害されており、Gpr158_Sf1^–/–マウスやOcn^–/–母マウスから生まれたOcn^–/–マウスでは、血圧低下や血中K⁺濃度上昇が、逆に、血中低カルボキシル化オステオカルシン量が上昇する骨芽細胞特異的Esp欠損マウスでは血圧上昇と血中K⁺濃度低下が観察された。Gpr158_Sf1^–/–胚とOcn^–/–母マウスのOcn^–/–胚の副腎皮質では、細胞増殖の有意な低下や、E16.5での副腎重量低下、Sf1およびその標的遺伝子Cyp11b2やCyp11b1の発現低下が、逆に骨芽細胞特異的Esp欠損マウスでは副腎重量の上昇が確認された。以上の結果から、発生過程におけるオステオカルシンシグナルが副腎の成長に寄与し、その効果は成体期を通じて持続するとことがわかった。

　副腎皮質はACTHによって制御されていることから、著者らは、オステオカルシンが視床下部-下垂体-副腎系による制御とは無関係に副腎の発生とステロイド産生を制御する可能性を検討した。オステオカルシンを母マウスに投与したMc2r^–/–胚の副腎はコントロールと比較してより大きく、出産時のMc2r^–/–仔マウスの致死を部分的にレスキューできたことから、オステオカルシンがACTHシグナルとは無関係に、もしくはACTH受容体の下流で、副腎の発生と分化に対する機能を有していることが示唆された。以上から、骨由来のオステオカルシンが胎児の副腎の発生を調節するフィードフォワード活性化が明らかになった。

POINT!

　ビスフォスフォネート系薬剤は骨を標的とし、骨吸収抑制薬として世界的に使用されている。窒素含有ビスフォスフォネートは破骨細胞のメバロン酸経路を阻害することで作用するが、これまでの研究で肺炎による死亡リスクも減少させることが示唆されていた。本研究で著者らは、蛍光標識したゾレドロン酸がin vivoで肺胞マクロファージや腹腔マクロファージに取り込まれることを明らかにした。さらに、マウスにゾレドロン酸を500 µg/kgで単回投与し48時間後に解析すると、肺胞マクロファージや腹腔マクロファージのメバロン酸経路が阻害され、メバロン酸経路代謝物の蓄積とタンパク質のプレニル化阻害が誘導されることがわかった。ゾレドロン酸の単回投与により、LPS刺激によって誘導される気管支肺胞液中のサイトカインとケモカイン産生量が上昇したが、著者らはタンパク質プレニル化の低下により、NLRP3インフラマソームの形成が促進されたことが原因であると考えている。以上の結果は窒素含有ビスフォスフォネートが骨にのみ作用するという長年の通説を覆し、肺における感染に対する免疫反応を高める可能性が示唆された。

POINT!

オートファジーは、細胞が持つ細胞内のたんぱく質を分解するための機構であり、生体内の恒常性維持に必須である。また、オートファジーは骨芽細胞や破骨細胞の分化や分泌を制御することで骨代謝に関わっており、この機能不全は骨代謝の破綻につながる可能性がある。しかし、オートファジーと骨関連疾患との関係は不明であった。筆者らは、オートファジーの抑制因子であるRubiconを骨芽細胞特異的に欠損させたマウス(rubcn^flox/flox; Sp7/Osterix-Cre)を作製し、骨芽細胞におけるオートファジーの活性化が骨形成を促進することを見出した。rubcn^flox/flox; Sp7/Osterix-Creマウスは大腿骨の海綿骨量が増加しており、骨粗鬆症モデルでは骨粗鬆症が改善した。この所見と一致して、骨芽細胞におけるRubiconの欠損は分化とミネラル化を促進し、Runx2、Bglap/Osteocalcinといった骨芽細胞の機能に関わる重要な転写因子の発現は上昇した。さらに、骨芽細胞におけるRubiconの欠損により、NOTCH細胞内ドメイン(NICD)のオートファジー分解が促進し、骨芽細胞の分化を負に制御するNOTCHシグナル伝達経路が抑制されることがわかった。以上の知見から、RubiconやNICDのオートファジー分解を標的とした薬剤が、加齢に伴う骨粗鬆症や骨折に対する新規治療につながる可能性が示された。

POINT!

骨の発生、リモデリング、そして骨折治癒時には、細胞の残骸および細胞外マトリックスが適切に除去される必要がある。骨基質の吸収は破骨細胞が担うが、軟骨基質の吸収を担う細胞種に関しては議論があり、統一した見解が得られていない。本論文で著者らは、間葉系ストロマ細胞に由来するfatty acid binding protein 5 (FABP5)陽性の「セプトクラスト」が、軟骨基質の分解と軟骨細胞の貪食に寄与する可能性を見出した。セプトクラストの存在は以前から形態学者らによって報告されていたが、著者らはFABP5陽性細胞のシングルセル解析をおこなうことで、はじめてセプトクラストの遺伝子発現情報を取得し、実体のある１つの細胞種として提示した。細胞系譜解析の結果から、セプトクラストは血球系でなく間葉系由来であることが示された。セプトクラストの分化には血管内皮細胞由来のNotchリガンドDelta-like 4 (DLL4)が必須であり、血管内皮特異的DLL4欠損マウスではセプトクラストの数が減少し、軟骨の吸収障害が生じた。セプトクラストの数は加齢に伴い減少したが、骨折時には血管新生に伴い再出現し、骨折治癒に寄与した。以上より、間葉系由来セプトクラストが、発生期骨形成および骨折治癒時に軟骨吸収を担う細胞種である可能性が示唆された。

POINT!

胸腺はT細胞の負の選択を介して免疫寛容に重要な役割を担う。骨髄移植ではHLA型が一致する場合でもauto-GVHDと呼ばれる自己免疫病態を呈することがある。そこで、auto-GVHDの病態に胸腺が果たす役割を調べるため、マウスの骨髄移植モデルを用いて、T細胞産生の回復と中枢性免疫寛容の回復をそれぞれ評価した。その結果、移植後の胸腺では、T細胞全体の産生は早期に回復する一方で制御性T細胞の産生は長期にわたって回復しないこと、T細胞の負の選択が阻害され、産生されたT細胞には自己反応性を示すものが存在することが判明した。さらに、骨髄移植は胸腺髄質上皮細胞(mTEC)および樹状細胞に長期的かつ深刻なダメージを与えることが明らかになった。移植後に産生されたT細胞の免疫寛容は必ずしも担保されないため、骨髄移植後のT細胞産生能力の回復と中枢性寛容の回復は別々に考察すべきである。以上より胸腺髄質の免疫回復期における重要性および骨髄移植後のauto-GVHD治療標的としての可能性が浮き彫りになった。

POINT!

長期間宇宙に滞在した宇宙飛行士は「宇宙貧血」といわれる貧血を経験することが知られている。今後、宇宙産業の進展に伴って長期間宇宙に滞在する機会が増えると考えられ、滞在時に宇宙貧血に適切に対処する必要がある。しかしながら、宇宙貧血の詳細なメカニズムは明らかになっていない。そこで、宇宙貧血の本態に迫るべく、筆者らは国際宇宙ステーションに約6ヶ月間滞在した14人の宇宙飛行士から飛行前・宇宙滞在中・帰還後における呼気ならびに血液を採取し、解析した。その結果、ヘモグロビンの代謝産物である呼気中COおよび血清鉄の濃度が宇宙滞在中継続的に上昇していることが判明し、宇宙貧血の本態は溶血性貧血であることが明らかになった。また、興味深いことに帰還1年後においても、呼気中CO濃度が高い状態に維持されており、帰還後も溶血が遷延していることが判明した。この発見は、宇宙貧血の病態を明らかにするのみならず、寝たきり等の抗重力運動が減弱した患者における貧血の病態解明にも寄与する可能性がある。しかしながら、溶血が起きる解剖学的部位およびメカニズムは依然として明らかではなく、今後の解析が望まれる。

POINT!

近年、腸内細菌叢と骨髄のクロストークが血液細胞の産生を制御していることが明らかになりつつある。しかし、腸内細菌叢が造血幹細胞へどのような影響を及ぼしているかは不明であった。本論文で著者らは、腸内細菌叢を欠損させたマウスの骨髄では、化学療法後の血液再構築時に造血幹細胞の自己複製が亢進し、血液細胞への分化が障害されていることを発見した。腸内細菌叢を欠くマウスの骨髄内の鉄量が減少していたため赤血球にGFPを発現させマクロファージによる貪食量を比較した。すると、腸内細菌叢欠損マウスでは骨髄マクロファージによる赤血球の貪食が障害されており、これによって鉄量が減少していることがわかった。そこで鉄欠乏食やCD169⁺マクロファージ除去実験により鉄量を低下させたところ、腸内細菌叢欠損マウスと同様に造血幹細胞の自己複製が亢進した。これにより血液再構築時には腸内細菌叢が鉄代謝を介して骨髄内造血幹細胞の自己複製や分化を制御することが明らかになった。本論文によって腸内細菌叢が造血幹細胞を制御する仕組みが新たに解明されただけでなく、腸内細菌叢と骨髄造血、マクロファージ、鉄代謝といった複雑なクロストークが骨髄環境を制御していることが明らかになった。

POINT!

CD169陽性マクロファージはリンパ節や脾臓に存在し病原体に対する免疫学的な防御に関係すると考えられている。筆者らは以前の報告でリンパ節の辺縁洞に局在するCD169陽性マクロファージ(Subcapsular sinusoidal macrophage: SSM)の分化には辺縁細網細胞(Marginal reticular cell: MRC)に発現しているRANKLが必須であることを示した（Camara, Immunity, 2019）。今回、筆者らはCd169-cre Ltbr^fl/fl (Ltbr cKO)マウスを解析することでLTβRシグナリングもRANKシグナリング同様にSSMの分化に必須であることを示した。さらに脾臓の辺縁帯に局在するCD169陽性マクロファージであるMarginal metallophilic macrophage (MMM)もリンパ節のSSMと同様にRANKシグナルとLTβRシグナルの両者が分化に必須であることを証明した。筆者らはRANKL reporter mouseを新たに作製し、Ltbr cKOを解析することで、MMMの分化には脾臓のMRCに発現しているRANKLが必須であることを示した。さらにLtbr cKOにおけるMMMの消失はウイルス特異的CD8T細胞の増加を阻害することを確認した。これらの結果により生体では免疫応答が必要な部位に適切にCD169陽性マクロファージが局在するよう、厳密な制御機構が働いていることが示唆された。

POINT!

強直性脊椎炎(Ankylosing spondylitis: AS)は主に軸骨格に影響する血清反応陰性の慢性関節炎である。異所性骨形成による骨癒合はASに特徴的であるが機序については不明であった。Ptpn11遺伝子にコードされているSHP2はユビキタスに発現しており、細胞の生存、増殖、分化を制御する。軟骨前駆細胞のSHP2を欠損させるとIndian hedgehogと Parathyroid hormone-related proteinの発現が上昇し、メタコンドロマトーシス（多発性の内軟骨腫と骨軟骨腫）が誘導されることが報告されていた。筆者らは偶然にCD4-Cre;Ptpn11^f/f (CD4-CKO)の成体マウスで後弯症、関節炎、および骨癒合といったASの病態生理学的特徴を示すことを発見した。このCD4-CKOマウスでは組織学的に成長板軟骨層の肥厚が確認された。CD4細胞はヘルパーT細胞の膜タンパクとして知られているため、当初はT細胞の機能異常がAS様症状を誘導していると考えられていたが、CD4-CKOマウス由来T細胞移入実験やLck-Cre; Ptpn11^f/fではAS様症状が再現されなかった。一方で野生型マウスの骨髄をCD4-CKOマウスに移入することで、AS様症状を示したことから、免疫系細胞の関与は否定的となった。次に筆者らは成体マウスでは成長板軟骨の前肥大・肥大軟骨細胞層においてCD4の発現があること、CD4-CKOマウスの前肥大・肥大軟骨細胞ではSHP2が欠損していることを免疫組織学的に証明した。さらにSHP2を欠損した軟骨細胞は増殖と分化が誘導されることで成長板軟骨層が増大することを示した。同様の現象は付着部炎関連関節炎の若年患者でも成長板軟骨層の肥厚として確認された。これらのことから成長板軟骨細胞の異常がASの進展に関係していることが示唆された。次に筆者らはSHP2-knockdownの培養軟骨細胞ではBMP6の発現が上昇していること、その培養上清はマウス骨髄間葉系幹細胞（Mouse bone mesenchymal stem cells: mBMSC）のSmad1/5のリン酸化を誘導することを示した。さらにSHP2-knockdownの培養軟骨細胞とmBMSCの共存培養では骨芽細胞分化が促進されることを示した。以上よりCD4-CKOマウスの成長板軟骨細胞は、BMP6/pSmad1/5 signalingを介して異所性骨形成を促進していることが示唆された。最後にHedgehog signaling阻害剤であるソニデギブの投与によって成長板軟骨を減少させるとCD4-CKOマウスのAS様症状が抑制されることを示した。これらの結果はソニデギブがASの有望な治療選択となる可能性を示唆している。

POINT!

外傷性脳損傷(traumatic brain injury, TBI)は、交通事故、転倒などでよく見られ、しばしば体の骨折が伴う。TBIを合併した骨折患者は、単純な骨折の患者よりも骨折の治癒時間が短いことが知られているが、そのメカニズムは不明である。著者らは、TBI患者の臨床検体とTBI骨折ラットモデルの血漿を調べたところ、小型細胞外小胞(small extracellular vesicles, sEV)が顕著に増加したことを見出した。sEVに対しmiRNA-seqを行い、骨形成を促進するmiR-328a-3pやmiR-150-5pが高発現していることがわかった。In vitroで骨髄間葉系幹細胞(BMSC)とマウス頭蓋冠由来細胞(MC3T3-E1)にmiR-328a-3pやmiR-150-5pを発現させたところ、骨芽細胞分化が促進された。さらに、sEVのプロテオミクス解析を行った結果、神経損傷と関連するA2Mタンパク質が増加したことから、TBI患者及びTBI骨折ラットモデルの血漿中で増加したsEVsは損傷した神経に由来することが示唆された。また、sEVの膜タンパク質fibronectin 1 (FN1)を阻害すると、sEVの骨折部位における集積が抑制されたことから、FN1はsEVを骨折部位へ遊走させる重要な因子であることが示唆された。最後に、miR-328a-3pを含むヒドロゲルをラットの骨折部位に移植した結果、骨折治癒が促進された。以上から、神経損傷による誘発されたsEVが骨折の早期治癒に寄与することがわかった。

POINT!

酸素は生命の営みにとって多様かつ重要な役割を果たしている。しかし、生体内の酸素分圧の定量化は困難であり、生理的環境下での酸素分圧(physioxia)の範囲や、酸素分圧の変動に対する各細胞の応答は明らかになっていない。そこで、筆者らは2光子励起顕微鏡を活用し、生体マウスの骨組織に存在する破骨細胞のphysioxiaの計測に成功した。生体の破骨細胞のphysioxiaは17.4〜36.4 mmHgであり、これはそれぞれ2〜5%の酸素濃度に対応している。この生理的な範囲内では、酸素濃度の低下によって破骨細胞の形成が阻害され、骨量が増加した。さらに、この機構は低酸素誘導因子のHIFからは独立しており、低酸素によってメチル化DNAの酸化反応を担う酵素Ten-eleven translocation (TET)の活性が低下することにより制御されていることがわかった。以上のことから、骨は他の組織とは異なる代謝経路で酸素分圧の変化に対応していることが判明した。本研究のように生体内の分子の濃度から生体の仕組みを理解することで、生体の恒常性の乱れや疾患発症を予測する医療技術の開発につながることが期待される。

POINT!

骨粗鬆症は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスの破綻により起こる加齢性疾患である。骨粗鬆症の病態には、造血細胞を含む骨髄の微小環境が関与する。加齢による遺伝子変異を伴うクローン造血はあるものの血液学的異常が認められないクローン性造血CHIP(clonal hematopoiesis of indeterminate potential)は、体細胞の突然変異に起因する。CHIPは高齢者において頻度が高く、造血器腫瘍のリスクとして知られている。筆者らは、UKバイオバンクにおけるコホートデータベースを解析することで、CHIPが骨粗鬆症における発症率の増加と骨密度の低下に関連していることを示した。CHIPで最も多く変異するDnmt3aを造血特異的に欠損したマウス（Dnmt3a^fl/flVav1-Creマウス）では、破骨細胞数が増加し、骨量が低下していた。Dnmt3a^fl/flVav1-Creマウスの血清を野生型マウスと比較すると、IL-20の発現量が高く、Dnmt3aが欠損した破骨細胞におけるゲノムワイドCRISPRスクリーニングでは、IL-20受容体の破骨細胞分化への関与が示された。さらに、Dnmt3aの変異における破骨細胞の形成は、Irf3-NF-kBのシグナルを介したマクロファージが発現するIL-20により誘導された。骨粗鬆症薬であるアレンドロネートやIL-20阻害は、Dnmt3aの変異により誘導された破骨細胞形成を抑制した。以上より、造血系におけるDnmt3aの変異は骨粗鬆症を引き起こすことが明らかになった。

POINT!

Dendritic cell immunoreceptor（DCIR）は糖鎖認識部位と免疫受容抑制性チロシンモチーフを持つC型レクチン受容体である。著者らのグループは、Dcir^–/–マウスが自己免疫腱付着部炎と唾液腺炎を自然発症することを以前に報告している。本研究では、DCIRが破骨細胞と樹状細胞で発現しており、アシアロ二本鎖N結合型糖鎖（NA2）に結合することを報告している。Dcir^–/–細胞では破骨細胞分化が亢進しており、NA2は野生型破骨細胞分化を阻害することがわかった。シアル酸残基を加水分解できるノイラミニダーゼを作用させることで二本鎖N結合型糖鎖のアシアロ化を誘導すると、in vitroにおいて破骨細胞分化を抑制し、樹状細胞の抗原提示機能を抑制することができた。マウスにノイラミニダーゼを投与すると、コラーゲン誘導性関節炎や多発性硬化症モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎症状がDCIR依存性に軽減された。これらの結果はDCIR活性が二本鎖N結合型糖鎖のシアル酸修飾によって調節されていることを明らかにし、自己免疫疾患や骨疾患において、DCIRあるいはNA2が新規治療標的となることが期待される。

POINT!

原発巣から播種された腫瘍細胞(disseminated tumor cells; DTCs)は骨髄に到達後、骨髄ニッチに生着し長期生存することが過去に報告されているが、その正確な位置やメカニズムは明らかになっていなかった。著者らは、骨髄の厚切り切片を免疫染色し3D再構成する技術を用いて、骨転移初期におけるDTCsの分布および増大に伴う血管微小環境の変化を観察した。乳腺への同所性移植により自然に骨転移する乳がん細胞株4T1.2をBALB/cマウスに移植し、原発巣切除後3週のマウス骨髄を観察したところ、DTCsが骨髄のType H vesselsの近傍に局在していることがわかった。さらに進行した骨転移巣では、血管が曲がりくねり、血管内皮細胞の突起 (vascular sprout)が多い構造をしていた。著者らは骨転移巣の血管内皮細胞に注目し、骨転移巣および転移のない骨髄の血管内皮細胞における遺伝子発現を調べたところ、骨転移巣の血管内皮細胞では血管新生や免疫細胞の遊走に関連する遺伝子が高発現していた。また、がん細胞の既存のデータから、骨転移の頻度が高い4T1, 4T1.2細胞株では骨転移の頻度が低い67NR, 66cl4細胞株と比較してCsf3 (G-CSF)の発現量が高いことがわかった。そこで、G-CSFの発現量が低い乳がん細胞株であるEMT6.5にG-CSFを過剰発現させたところ、G-CSFの過剰発現により骨転移巣が増大し、vascular sproutが増加した。さらに、G-CSFによる血管再構成における血球系細胞の寄与を調べるため、リンパ球、好中球、マクロファージ除去モデルを用いた検討を行ったが、骨転移巣の増大やvascular sprout形成に影響はなかった。最後に、G-CSFの阻害が骨転移の新規治療標的となる可能性を考え、4T1.2の骨転移モデルにおいてanti-G-CSFRの投与実験を行った。その結果、転移早期にanti-G-CSFR投与すると、骨転移は有意に抑制され、vascular sproutの形成が阻害された。以上により、DTCs由来のG-CSFが血球系細胞とは独立したメカニズムにより血管をリモデリングし、骨転移の増大に有利な血管微小環境を構築していることが明らかになった。

POINT!

矯正学的歯の移動は、メカニカルストレスによる骨リモデリングの一例として知られている。矯正力は、歯根と歯槽骨を繋ぎ留める結合組織、歯根膜を介して歯槽骨へ伝達され骨リモデリングを誘導し歯の移動を引き起こす。歯根膜は力の伝達に重要である他、近年では矯正力に応答してサイトカインの分泌などを行い、歯の移動に関わっていると考えられている。著者らは、メカノセンサーの一つ、Piezo1が矯正学的歯の移動に関わると仮定した。矯正学的歯の移動モデルラットの免疫組織学的解析から、Piezo1が牽引側 (歯が移動するのと逆側) の歯根膜で発現することを見出した。Piezo1阻害剤の腹腔内投与により全身的にPiezo1を不活性化し、矯正モデルを実施したところ、歯の移動が抑制された。組織学的には、牽引側における骨形成と骨吸収が抑制されていた。以上より、Piezo1を介した力学刺激は歯の移動に影響することが明らかになった。なお、Piezo1は骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞など他の様々な細胞で発現しており、阻害剤の全身投与ではタイトルにあるような「歯根膜のPiezoシグナルによる骨リモデリング制御」の証明とならないことには留意されたい。また、多くのデータがパラフィン切片の免疫組織染色法に基づいているが、歯根膜が非特異的に抗体を結合しやすいことは多くの研究者が認めるところである。矯正力が歯槽骨リモデリングを誘導するメカニズムを解明するためには、より詳細な検討が必要である。

POINT!

骨形成不全症 (OI) には21の類型があり、主にコラーゲン合成系に関わる遺伝子の変異が報告されている。15型のOI (OI-XV) 患者においては、WNT1^G177C変異が報告されている。In silico解析から、この変異によりWNT1の安定性が損なわれることが予想されていた。WNT1^G177Cを強制発現させたST2細胞では、野生型WNT1発現細胞とは異なり骨芽細胞分化の促進効果が認められず、この変異が機能喪失型の変異であることがわかった。そこで、この変異を有する遺伝子改変マウスを作出したところ、このマウスでは高頻度の骨折を認めた。椎骨の骨形態計測法による解析の結果、海綿骨と皮質骨の両方でWNT1^G177Cマウスにおける骨形成の低下に伴う骨量減少を認めた。OI-XV患者にはビスホスホネート製剤が奏功しないことから、他の治療オプションが望まれている。PTH投与はWNT1^G177Cマウスに対して治療効果を発揮したが、副作用の問題から小児への投与や長期投与は推奨されない。WNT受容体LRP5の変異体でスクレロスチンに対する親和性の低いもの (LRP5^A213V) を利用した治療を着想し、WNT1^G177CとLRP5^A213Vの両方の変異を有するマウスを作出したところ、WNT1^G177Cマウスと比べて骨のパラメーターが改善した。このことから、LRP5はOI-XV治療の標的となると考えられた。

POINT!

子宮内膜症は、子宮内膜様の組織が異所性に発育する疾患であり、罹患率の高さや悪性転化率の高さから、臨床的にも社会的にも問題となっている。子宮内膜症病変部ではtype IIの免疫細胞の増加が認められることから、病態形成への関与が指摘されていた。著者らは過去にtype II炎症反応に重要なIL-33が腹腔液や子宮内膜症病変部に多いことを見出した。Type II innate lymphoid cell (ILC2) はIL-33により活性化される比較的新しい免疫細胞で、子宮内膜症への関与は不明であった。本研究において、著者らは子宮内膜症患者の腹腔液中にILC2 (CD45⁺Lin^–CD127⁺CD294⁺ST2⁺細胞) を見いだした。病変部の解析から、IL-33は上皮細胞と間質細胞で発現することが確認された。野生型マウスに対するIL-33投与は腹腔液におけるtype IIサイトカイン産生や、好酸球とILC2の割合を増加させた。さらに、細胞増殖の促進、血管新生に関わる遺伝子の発現上昇、神経の増加、線維化の亢進が認められた。ILC2がIL-33の標的となりうるかを、Rag2^–/–Il2rg^–/–マウスと抗CD90.2抗体を投与したRag2^–/–マウスを用いて検討したところ、これらのマウスはコントロールのRag2^-/–マウスと比較してIL-33誘導性の炎症反応が認められず、免疫細胞の浸潤も低下していた。さらに、細胞増殖と線維化も抑制された。以上より、子宮内膜症におけるIL-33誘導性の病態形成へのILC2の関与が示された。

POINT!

骨芽細胞は骨基質内に埋め込まれて樹状突起を有する骨細胞に分化するが、この過程の分子機構は十分に理解されてはいなかった。本研究で著者らは、Dmp1-CreによりSp7（Osterix遺伝子）を欠損させると、皮質骨の多孔化、骨塩量の低下、皮質骨内の異常な骨リモデリングに加え、骨細胞のアポトーシス増加と樹状突起の異常が誘導されることを明らかにした。Sp7ノックダウンおよび過剰発現Ocy454細胞のRNA-seq解析やSp7のChIP-seq解析により、骨細胞特異的なSp7標的遺伝子は骨芽細胞特異的標的遺伝子とは異なり、Dlxファミリー転写因子ではなくAP1ファミリー転写因子が結合する細胞突起形成や神経細胞の発生に関連する遺伝子が濃縮されていることが示された。また、RNA-seqとChIP-seq解析で共通して同定された77の骨細胞特異的Sp7標的遺伝子のうち、著者らは分泌型タンパク質をコードするOstn（Osteocrin遺伝子）に着目した。Ostnの強制発現はin vitroでもin vivoでもSp7欠損による骨細胞の樹状突起の異常をレスキューし、in vivoでは骨細胞のアポトーシスや皮質骨多孔化なども抑制したことから、骨細胞の樹状突起形成/維持を促進する分泌因子であることが明らかになった。さらに、著者らはDmp1-Cre; Ai14マウスを用い、酵素消化により骨基質から骨細胞を回収してソーティングし、シングルセルRNA-seq解析を行うことで骨細胞分化過程の詳しい細胞集団を調べた。その結果、8つのポピュレーションとそれらに特徴的な遺伝子が同定され、擬時間解析による分化経路推定により骨芽細胞から成熟骨細胞へは２つの経路を介する可能性が示された。Sp7欠損マウスで同様の解析を行ったところ、分化途中クラスターのうち、片側の経路の相対的割合が増加し成熟骨細胞クラスターが減少していたことから、Sp7非存在下ではこの分化プロセスに欠陥があることが明らかにされた。また、ヒトにおける骨細胞SP7の役割を調べたところ、SP7依存的な骨細胞遺伝子ネットワークはヒトの骨格系疾患と関連しており、骨形成不全症を示すSP7^R316C変異を持つヒトの骨細胞は樹状突起の長さと数が減少していることを示した。以上の結果から、Sp7は骨細胞分化過程で細胞の形態形成を促進する中心的な役割を担っていることが明らかになった。

POINT!

エクササイズは一般的に、ヒトや動物の健康のあらゆる側面に有益であり、認知機能の老化や神経変性を遅らせることが知られている。運動による認知機能の向上は、海馬内の可塑性の増加や炎症の抑制と関連しているが、これらの効果に関わる因子やメカニズムについてはほとんど分かっていなかった。本研究で著者らは、28日間自発的にランニングホイールで走る環境で過ごしたマウスから採取した血漿を通常のマウスに投与すると、通常マウス血漿と比較して海馬の神経増殖を促進し、文脈的学習・記憶および空間的学習・記憶を高めることを明らかにした。海馬のRNA-seq解析から、エクササイズ血漿の投与により学習・記憶に関わる遺伝子に加え、神経炎症性遺伝子発現が低下し、LPS投与により実験的に誘導した脳内炎症モデルマウスの炎症が軽減することが示された。血漿プロテオーム解析の結果、エクササイズにより特に凝固系や補体系が変化しており、この解析で同定されたエクササイズにより誘導される血中分子の上位4つをそれぞれ抗体により除去することで比較したところ、補体カスケード抑制因子clusterin（CLU）がエクササイズ血漿による抗炎症作用に関わる主な因子であることが明らかにされた。CLUは主に肝細胞や心筋細胞で発現しており、リコンビナントCLUを投与すると脳血管内皮細胞に結合し急性脳炎モデルおよびアルツハイマー病モデルマウスにおける神経炎症性遺伝子発現を低下させることが確認された。さらに、マウスで得られた結果と同様に、認知機能障害患者でも6ヶ月間の運動で介入前と比較してCLUを含む補体系や凝固系因子の血漿中濃度が変化した。これらの知見は、運動によって誘導され、脳血管系を標的とする投与可能な抗炎症性の因子が、エクササイズを行うヒトに存在することを示している。

POINT!

組織にはマクロファージが豊富に存在し、組織の発生、恒常性維持、再生、病態形成などに関与している。多くの組織常在マクロファージ集団は、単離されex vivoでプロファイリングされているが、その収量はin situでの存在量に比べて低いことが多く、in vivoに存在する多様なマクロファージが網羅的にサンプリングされているかは不明であった。骨髄などの組織常在マクロファージを同定するために一般的に使用されているフローサイトメトリーでは、骨髄内にF4/80を発現する多くの細胞が存在し、これらの約3分の1は組織常在マクロファージマーカーCD169と成熟マーカーVCAM-1を発現している。しかし、骨髄F4/80⁺CD169⁺VCAM-1⁺細胞のイメージングサイトメトリー解析では、CD11bの染色パターンが細胞膜全体に均一に分布しているのに対し、F4/80、CD169、VCAM-1の染色パターンは点状でそれぞれ重複して分布し、明視野画像で明らかな細胞境界を超えて存在していた。Csf1r-EGFPやSiglec1^Cre; R26^ZsGreenマウスから採取した細胞をLineage markerでネガティブセレクションして得られた推定マクロファージでも、F4/80は極性化した点状の染色パターンを示し、多くのGFPやZsGreenはF4/80と共局在して点状の蛍光を示し、インタクトなマクロファージは存在しなかった。これらの結果は、従来のフローサイトメトリーでは組織常在マクロファージと解釈される細胞が、細胞調製中に破壊されたマクロファージ断片をまとった非マクロファージ細胞であることを示唆している。さらに、マクロファージ残骸は、骨髄や脾臓の赤芽球、B細胞、T細胞、好中球などの成熟した造血系細胞と結合しており、その結合プロファイルはin vivoでのマクロファージと他の細胞との相互作用を反映していた。また、Siglec1^DTR/+マウスを用いてCD169⁺マクロファージをin vivoで除去すると、F4/80⁺残骸の付着が解消されることや、マクロファージ残骸には細胞質だけでなくマクロファージのmRNAが含まれ、造血幹前駆細胞を含む非マクロファージ細胞で誤って検出されてしまうことも示された。Csf1r-EGFPマウス骨髄細胞を従来の方法で選別したマクロファージとされる集団のRNA-seq解析では、単球/マクロファージではなく顆粒球に特徴的な遺伝子が濃縮されており、一般に公開されているデータセットでも、マクロファージの断片化により造血組織のRNA-seq解析やシングルセル解析においてマクロファージ残骸由来のmRNAが他の細胞に誤って帰属しており、このことは一般的な現象であることが明らかにされた。造血組織マクロファージの断片化は、ex vivoにおけるマクロファージの分子プロファイリングの正確性を損なうことから、十分な注意が必要であることが示された。

POINT!

成長板休止細胞層(Resting zone of the gowth plate: RZ)の軟骨細胞は細胞周期が長いことを特徴とし、副甲状腺関連タンパク(PTHrP)を発現している骨格系幹細胞(Skeletal stem cell: SSC)を含む。このRZに存在するSSCは増殖層軟骨細胞の供給源であるうえに、増殖層軟骨細胞の増殖能を維持するPTHrPを産生することで成長板の長軸方向の伸長に貢献する。これまでのところRZの軟骨細胞がどのように維持されているのかは不明であった。著者らは新規作製したCol2a1発現細胞特異的にtetracycline-controlled transactivator (tTA)を発現するマウス(Col2a1-tTA)とtTAによって核内にEGFPが発現するマウス(TRE-H2B-EGFP)を交配しChondrocyte-specific Tet-Off systemを確立した。Chondrocyte-specific Tet-Off system ではdoxycycline投与によって核内へのEGFPの集積が停止するため分裂後の細胞ではEGFPの発現が希釈される。筆者らはEGFPの発現が強い細胞(Label-retaining chondrocyte: LRC)=分裂していない細胞がRZに局在していることを蛍光顕微鏡で確認した。またEGFPの発現が弱い細胞（non-LRCs）に比べLRCの方がEdU陽性細胞の頻度が少ないことから細胞周期が長いことを確認した。筆者らはLRCsとnon-LRCsのRNA-seqを行い発現遺伝子を比較した。その結果LRCsではWnt signalingのinhibitor (Sfrp1, Sfrp5, Dkk2, Wif1, Notum, Fzd6) がnon-LRCsではWnt signalingのactivator(Rspo3, Rspo4 , Wnt10b)の発現が増加していることがわかった。このことからRZの軟骨細胞の維持にはWnt signalingの阻害が必要であることが示唆された。次にWnt signalingがどのようにRZを制御しているかを解明するために、RZのSSC特異的にWnt/β-catenin シグナルを活性化するPthlh-creERT; APC flox/+マウスを解析した。このマウスではSSCであるPTHrP陽性細胞が減少し、さらに軟骨柱の形成も阻害されていた。これらの結果からRZの維持と分化にはWnt signaling阻害が必須であることが示された。

POINT!

高齢化に伴い、世界各国が骨粗鬆症性骨折の増加という問題に直面している。RSPO3遺伝子座は骨折との遺伝的関連性が報告されているが、その原因遺伝子やメカニズムは不明である。本研究では、筆者らはヒトの遺伝学的解析とマウスの機能解析によってRSPO3の骨代謝と骨折における働きを明らかにした。ヒトの大規模遺伝子解析において、RSPO3遺伝子座の骨折抑制アレルはmRNAおよびたんぱく質レベルでのRSPO3発現、海綿骨骨密度の増加、前腕骨遠位部の骨折リスクの低下と関連していた。ヒトとマウスの骨組織では、骨芽細胞前駆細胞と骨芽細胞がRSPO3を発現していた。筆者らはRunx2-creRspo3^flox/floxマウス、Dmp1-creRspo3^flox/floxマウス、CAGGCre-ER-Rspo3^flox/floxマウスをそれぞれ作製し、マイクロCTや骨形態の評価によってRunx2-creRspo3^flox/floxマウスとタモキシフェンを投与したCAGGCre-ER-Rspo3^flox/floxマウスで著明に海綿骨量が減少することから、骨芽細胞が骨におけるRSPO3の主要な供給源で、成獣マウスの椎体海綿骨量と骨強度の重要な制御因子であることを示した。さらに、マウス骨芽細胞の培養実験により、骨芽細胞から分泌されたRSPO3が骨芽細胞の分化と増殖を促進することも明らかにした。以上のことから、RSPO3はマウスの椎体海綿骨骨量と骨強度、そしてヒトの骨折リスクを制御していると考えられる。

POINT!

鎌状赤血球症(SCD)は、溶血性貧血・血管閉塞を特徴とした先天性の血液疾患である。重度の貧血や血管閉塞は組織の低酸素化を引き起こし、多臓器障害の原因となりうる。SCDの治療選択肢の1つに造血幹細胞(HSC)移植があるが、HSCの生着には適正な骨髄微小環境が必要である。しかし、SCDでは、HSCのホメオスタシスを厳密に制御する骨髄間葉系幹細胞(MSC)にScf、Cxcl12遺伝子の発現低下(いずれもHSC維持に関与する遺伝子)が見られることが知られている。このことがSCDにおけるHSC生着率の低下に関与している可能性が考えられるが、SCDにおけるMSCの機能は明らかになっていない。そこで著者らは、SCDモデルマウスを使用し、SCDにおけるMSCの機能・HSCとの関連性に解析した。まず、SCDマウスにおける特徴として、MSCにおけるScf、Opn遺伝子発現減少、骨髄中HSC数減少、末梢血中HSC数増加が見られることを確認した。この結果から、SCDでは、MSCによるHSCの維持能力が低下していることが示唆された。次に、先行研究(赤血球から遊離したヘムが血管内皮細胞のTLR4シグナルを活性化することにより、血管収縮・炎症反応亢進が誘発される)を元に、ヘム、TLR4に着目し、これらとMSCの関連性を検討した。WTマウスへのヘミン(ヘムの一種)投与、SCDマウスへのTLR4阻害剤投与実験を実施し、MSCにおけるヘムと、それに伴うTLR4シグナル活性化がMSCのHSC維持能力の低下に寄与していること明らかにした。以上より、SCDではMSCの機能的特性が損なわれている。従って、SCDにおける骨髄移植では造血幹細胞の生着を最適化するために、TLR4経路の抑制が治療ターゲットとなりうる可能性が示された。

POINT!

骨転移は強い疼痛をもたらすことが知られており、効果的な治療法の開発が重要な課題となっている。筆者らは、新規治療薬の候補としてSTING (stimulator of interferon genes)に注目した。STINGは小胞体局在の4回膜貫通性タンパク質で、感染などにより細胞質に異種の二本鎖DNAが出現すると活性化されtype-I IFN (IFN-I)合成を促進する。2021年に、筆者らはSTINGの活性化によるIFN-I分泌促進が生理的・病的状態における痛覚を抑制することをNatureに報告した。しかし、骨転移の疼痛に対する効果は不明であった。筆者らはマウス肺がん細胞株LLCを大腿骨骨髄腔へ移入するモデルを用いて、STING agonistの投与により骨転移モデルマウスにおける足の疼痛反応および運動機能障害が改善することを示した。また、STING agonistの投与は骨転移巣における骨量低下を抑制した。これらの効果は、Ifnar1 KOマウスにおいては見られなかったことから、STINGの活性化によるIFN-Iの増加が関与していることが考えられた。続いて、感覚神経への影響を詳細にみるためにマウスのL3-L5 DRGをex vivoで解析したところ、骨転移モデルマウスではナイーブマウスと比較して過興奮状態にあり、STING agonistの投与により過興奮状態は抑制された。一方で感覚神経特異的にIfnar1を欠損させたマウスではSTING agonistの投与による疼痛抑制が打ち消され、IFN-Iシグナルによる直接的な感覚神経の抑制が示された。さらに、腫瘍免疫への影響をみたところ、STING agonist投与により骨髄中のCD8⁺ T細胞の割合が増加し、腫瘍の進展も抑制されていた。骨解析を行ったところ、STING agonist投与は骨転移巣における破骨細胞の増加を抑制することが示され、in vitroでの検討によりIFN-Iシグナルが破骨細胞分化を抑制することが示された。以上の結果により、STINGによるIFN-Iシグナルの活性化は、骨転移巣において感覚神経の興奮を直接抑制するだけでなく、CD8⁺ T細胞の活性化および破骨細胞の抑制を介して、腫瘍の進展と骨破壊を抑制し、痛覚刺激性メディエーターの分泌を抑制していることが明らかになった。STING agonistは複合的な作用により骨転移の疼痛を緩和する新規治療薬となる可能性が示された。

POINT!

IKAROS zinc-finger (IKZF)ファミリーは、造血に不可欠な転写因子群である。AIOLOS(IKZF3)はIKALOS(IKZF1)と会合し、ゲノムに結合することで遺伝子発現を制御している。本研究において、筆者らは免疫不全症の家系からAIOLOSのアミノ酸置換を伴う変異を同定した。変異型AIOLOSを導入にしたマウスでは、B細胞の分化障害が観察されたが、二量体化に関わるドメインを欠損させることで、B細胞分化の回復が認められた。変異型AIOLOSとIKALOSのヘテロダイマーは、適切なゲノム領域に結合することがでず、IKALOSの機能を阻害することでリンパ球の分化を障害することが示された。以上より筆者らは、免疫不全症が生じる新規分子メカニズムを解明し、その治療戦略を示した。

POINT!

脳組織には神経細胞を上回る数のグリア細胞が存在し、生理的・病理的条件下で様々な機能を発揮する。しかし、代表的な神経疾患であるアルツハイマー病 (AD) におけるグリア細胞の機能には不明な点が多い。IL-3は血液幹細胞の増殖因子と考えられていたが、その他にも神経細胞のアポトーシス抑制など、多様な機能を有するサイトカインである。マウスにおいて、IL-3は血清よりも脳脊髄液で4倍の濃度を示したことから、IL-3は脳内で産生され、神経保護作用を発揮することが示唆された。そこで、IL-3を欠損するADモデルマウス (Il3^–/–5xFADマウス) の解析を行ったところ、短期記憶と空間記憶機能の障害を見出した。IL-3レポーター/folxマウス (Il3^GFPf/fマウス) の脳組織の解析から、アストロサイトの4%がIL-3陽性であった一方、ミクログリアや他の非血球系細胞はIL-3陰性であることが分かった。ADモデルマウスの脳組織におけるIL-3発現はコントロールマウスと同程度であったことから、IL-3はアストロサイトで恒常的に発現すると考えられた。IL-3Rα発現細胞を探索し、ミクログリアがIL-3に応答しうることが見出された。老齢マウスでは約半数のミクログリアがIL-3Rα陽性であった。これらの細胞はアミロイド斑周辺に存在しており、アミロイドを除去している可能性が示唆された。TREM2/DAP12複合体は脳内ではミクログリアで発現し、ミクログリア機能に重要であることが知られている。Trem2^−/−5xFADマウスではAD発症に伴うIl3raの発現上昇が減弱していた。これらの結果から、ミクログリアのIL-3応答性はTREM2/DAP12シグナル依存的であると考えられた。ヒトの脳組織においても、IL-3はアストロサイトで発現すること、ADの有無によらずIL-3は一定レベルの発現を示すこと、IL-3RαはAD患者のミクログリアで発現が高いことが確認された。ADのリスク因子として知られるAPOE4遺伝型のサンプルでは特にIL-3Rαが高発現を示した。次に、ミクログリアの活性化状態とアミロイド斑除去能を透明化ホールマウント法により評価した。5xFADマウスではミクログリアはアメボイド型 (活性化状態) を呈し、アミロイド斑の凝集像が認められた。一方、Il3^–/–5xFADマウスではミクログリアはラミファイド型 (定常状態) で散在しており、アミロイドの凝集も認められなかった。マイクロ流路を用いた実験により、IL-3によってヒトiPS細胞由来のミクログリアがヒトアミロイドβやリン酸化タウタンパク質に向かって遊走することが示された。アストロサイト特異的Il3欠損ADモデルマウス (タモキシフェン投与Il3^GFPfl/flAldh1l1^CreERT25xFADマウス) およびミクログリア特異的IL-3Rα欠損ADモデルマウス (タモキシフェン投与Il3ra^fl/flCx3cr1^CreERT25xFADマウス) では、アミロイド斑の沈着が増加し記憶機能の低下が認められた。一方、5xFADマウスの側脳室にIL-3を継続的に投与したところ、記憶機能の改善が見られた。以上より、ADで活性化したミクログリアはIL-3Rαを高発現し、アストロサイトが恒常的に発現するIL-3に対する応答性が高まり、アミロイド斑が除去され記憶低下が防がれることが示された。さらに、IL-3投与がAD治療に有効である可能性が示された。

POINT!

「制御された細胞死」は様々な組織で見られる現象で、生体の発生や恒常性の維持に重要である。腸管上皮のターンオーバーはその代表例である。腸管には多数の細菌が存在し、腸管上皮死細胞と何らかの関係があると古くから指摘されているが、直接的な関係は証明されていなかった。著者らはまず、腸管の組織片を摘出し、ex vivoでスタウロスポリンまたはドキソルビシンによりアポトーシスを誘発した。死細胞の上清をSalmonellaに添加したところ、細菌の増殖活性が上昇した。Vil-cre^+/−Casp3/7^fl/flマウスを用いることにより腸管上皮細胞でアポトーシスが抑制される条件で同様の実験を行ったところ、Salmonellaの増殖促進は認められなかったことから、腸管上皮死細胞より放出される成分が重要であることが示された。RIPK1、MLKL、GasD、Caspase1、Caspase11といったネクロプトーシスやパイロプトーシスに必須の分子を欠く条件ではコントロールと同様に細菌増殖を認めたことから、Caspase3/7依存的なアポトーシスが増殖に必要であることが明らかになった。また、K. pneumoneaeやE. coliもアポトーシス細胞の上清により増殖したことから、多くの細菌で普遍的にな現象であることが示唆された。アポトーシス細胞の上清の分子量による分画、加熱処理や酵素処理の実験の結果、細菌増殖活性を有するのは、3 kDa未満の低分子であると考えられた。著者らは、アポトーシスに伴う栄養の放出現象をDINNRと名付けた。次に、DINNRで増殖を誘導した細菌の遺伝子発現を網羅的に解析し、抽出された増殖に関与しうる遺伝子をノックアウトした。その結果、ピルビン酸ギ酸リアーゼのpflBを欠損するSalmonellaはDINNR誘導性の増殖が認められなかった。アポトーシス細胞からはピルビン酸が多く含まれ、ピルビン酸キナーゼ阻害剤シコニンはDINNR誘導性細菌増殖を阻害したことから、ピルビン酸が特に重要であることが示された。細胞膜チャネル分子Panx1のドミナントネガティブ体を発現する細胞はDINNR誘導性細菌増殖を誘導しないことから、Panx1は細菌増殖因子の放出に寄与することが示された。細菌の競合感染アッセイの結果、pflBを欠損するSalmonellaは野生型に比べ定着能が低かった。Vil-cre^+/−Casp3/7^fl/flマウスでは、野生株/PflB欠損株比が小さいことから、PflBによる生存はアポトーシス依存的であることが生体レベルで示された。癌化学療法は、腸管内のProteovbacteria増加を引き起こすことが知られている。化学療法に伴う腸管上皮のアポトーシスが細菌の増加に寄与するかを検討するために、マウスにドキソルビシンを投与した。これにより、腸管におけるSalmonellaは増加した。Vil-cre^+/−Casp3/7^fl/flマウスにドキソルビシンを投与し、Salmonella野生株/PflB欠損株競合アッセイを行ったところ、これらのマウスでは野生株/PflB欠損株比は低かった。Panx1^–/–マウスにドキソルビシンを投与し、同様のアッセイを行ったところ、野生株/PflB欠損株比は低かった。以上より、腸管上皮細胞のアポトーシスによりPanx1より放出される低分子は、腸内細菌に利用され、増殖活性を増大させることが示された。

POINT!

Krüppel-like factor 5 (KLF5) は細胞の増殖や分化を幅広く制御する転写因子である。著者らは、過去にこの分子が筋細胞分化の過程でMyoDやMef2と協調して分化を制御することを明らかにした。今回、著者らは筋萎縮の過程でもKLF5が機能しうるかを検討した。筋芽細胞株C2C12細胞の筋線維への分化系に対してデキサメタゾン (Dex) を添加することで筋萎縮を誘導したところ、Klf5遺伝子およびKLF5タンパク質の発現が速やかに誘導された。骨格筋特異的Klf5欠損マウス (Ckm–Cre Klf5^f/fマウス) を解析したところ、定常状態では腓腹筋の筋線維径や筋機能に有意な変化は認められなかった。このマウスに対してKLF5発現上昇を伴うin vivoの筋萎縮モデルとして尾部懸垂モデルを実施した。これにより後肢への荷重を除去したところ、対照群マウスの腓腹筋やヒラメ筋の筋量およびMyl2発現が減少したのに対して、Ckm–Cre Klf5^f/fマウスではそのような変化は認められなかった。以上より、KLF5は筋萎縮時に誘導され萎縮を進行させる機能を有することが示された。このマウスより得られた初代培養筋衛星細胞 (SC) に対してDexを添加したところ、コントロールマウス由来のSCと比べ萎縮が著しく抑制されていた。Dex処理SCの遺伝子発現の網羅的解析から、筋萎縮に伴い発現変動する遺伝子群のうち、特に代謝に関わる遺伝子の多くがKLF5依存的であることが見出された。ChIP-Seq解析およびルシフェラーゼアッセイの結果、筋萎縮時にはKLF5はFoxo1と協調してFbxo32発現を誘導することが明らかになった。KLF5の筋萎縮誘導能が示されたことから、著者らはKLF5阻害による筋萎縮治療法の確立を試みた。レチノイン酸受容体アゴニストのAm80 (タミバロテン) はKLK5の発現と活性を抑制することが知られている。これをin vitroおよびin vivoの筋萎縮モデルに投与したところ、Fbxo32のプロモーター活性が低下し、筋萎縮が抑制された。In vivoでの筋萎縮抑制作用は、尾部懸垂が14日という長期間に及んだ場合でも認められた。サルコペニア治療の実臨床においてもKLF5が治療標的となりうるか検討するために、ヒトを対象としたRNA-Seq公共データベースを用いた解析を行なった。寝たきりや加齢といった条件下でKLF5発現は上昇し、また、KLF5発現はFBXO32やTRIM63の発現と相関していた。このことから、ヒトの場合においてもAm80による筋萎縮抑制が可能と考えられる。Am80は急性前骨髄球性白血病治療薬として使用されている実績があることから、新薬を開発する場合と比較して低コスト、短期間でサルコペニア治療の臨床に用いられることが期待できる。

POINT!

老化は細胞内因性の変化によって引き起こされるが、細胞外因性の因子もその開始や進行に関わることが知られている。本研究で著者らは、マウス骨格幹細胞（SSC）自体が加齢することで骨髄ニッチでのシグナル伝達が変化して骨と血球系の分化が偏り、骨の脆弱化が誘導されることを明らかにした。免疫不全NSGマウスの腎被膜下移植実験から、加齢したSSCは骨軟骨形成能力が低下する一方で、炎症性サイトカインや骨吸収促進サイトカインを高レベルで発現する間質細胞により分化しやすくなることが明らかになった。老齢マウスと若齢マウスとの並体結合（ヘテロクロニック）実験では、老齢マウス側SSCの骨軟骨形成能の低下は回復せず、老齢マウス側の骨量や骨折再生実験における仮骨BMDやSSCの頻度およびin vitro骨軟骨分化能も改善しなかった。対照的に、ヘテロクロニック並体結合における若齢マウス側のBMDとSSC頻度は、若齢マウス同士の並体結合と比較して有意に低下し、骨折再生実験における破骨細胞活性が上昇した。また、造血幹細胞（HSC）加齢の特徴としてミエロイド系分化への偏りが知られているが、2ヶ月齢マウスから採取したHSCを2ヶ月齢または24ヶ月齢のマウスに移植したところ、ドナー由来末梢血細胞および骨髄細胞の組成は24ヶ月齢マウスでミエロイド系に偏っていた。次に、24ヶ月齢マウスのSSC由来間質細胞と共培養したHSCを移植すると、2ヶ月齢マウスSSC由来間質細胞を用いた場合と比較して、末梢血中および骨髄中のミエロイド系細胞の割合が増加した一方、リンパ系細胞は減少した。これらの結果から、老化SSC由来細胞が加齢に伴う造血系のミエロイド系分化への偏りを促進し、SSCの老化が造血系の老化のドライバーになっていることが示唆された。さらに、3日齢、2ヶ月齢、24ヶ月齢マウスの長管骨由来SSCのシングルセルRNA-seq解析から、加齢マウスにおけるSSCの機能低下とトランスクリプトーム多様性の低下が関連しており、加齢SSCが骨形成能を失う一方で造血系細胞との相互作用が増加し、これが骨髄ニッチの変化に寄与している可能性が示された。また、経時的なSSC、BCSP、Thy1⁺および6C3⁺細胞（著者らが以前同定したSSC系列細胞ポピュレーション）のトランスクリプトーム解析の結果、RANKLは2ヶ月齢から高いレベルで発現していたのに対し、CSF1は24ヶ月齢マウスでの上昇が顕著であったことから、著者らはCSF1に着目した。加齢SSCにおける骨軟骨形成能低下と破骨細胞分化促進ニッチ形成能上昇を制御するため、BMP2、CSF1抗体、2つの組み合わせ、またはPBSを含むハイドロゲルを24ヶ月齢マウスの骨折モデル局所に投与した。その結果、BMP2とCSF1抗体の組み合わせにより加齢したSSCを再活性化させ、同時に炎症や破骨細胞形成を促進する環境を抑制することで、若齢と同等レベルに戻すことが可能であった。また、高用量のCSF1抗体とBMP2の組み合わせは骨折修復後の力学的強度改善能が低かったことから、健康的な骨リモデリングと骨再生のためには、SSC系列細胞から分泌されるCSF1の量が厳密にコントロールされている必要があることが示唆された。以上から、本研究は骨格の老化の原因となっている複雑で多因子性のメカニズムを明らかにし、老化した骨格を若返らせることができる可能性を示した。

POINT!

骨間質は、骨形成や造血の制御だけでなく骨折の治癒や病気の進行にも寄与している。骨間葉系間質細胞（BMSC）は、分子的・機能的に異なる特性を持つ様々なサブポピュレーションを含む不均一な細胞集団である。BMSCのサブセット間の関係性や、その制御機構についてはよくわかっていなかった。本研究で著者らは、Pdgfra-GFPマウスやHey1-GFPマウスを用いることで、骨幹端のPDGFRa⁺b⁺Hey1⁺ BMSC（mpMSC）と骨幹のPDGFRa⁺b⁺Hey1^– BMSC（dpMSC）が異なる性質をもつことを発見した。これらの細胞のRNA-seq解析や培養実験によって、dpMSCと比べてmpMSCはBMSCマーカー遺伝子や血管・骨格発生に関連する遺伝子発現が高く、コロニー形成能や骨、脂肪、軟骨の各系統への分化能も有意に高かった。また、Pdgfrb-Cre^ERT2、Lepr-Cre^ERT2およびGli1-Cre^ERT2のそれぞれのマウスを Rosa26-mTmGレポーターマウスと交配してタモキシフェン投与により行った系統追跡実験とシングルセルRNA-seq解析により、レプチン受容体陽性細網細胞を含むdpMSCと骨芽細胞系列細胞は骨幹端においてmpMSCから発生することが示された。骨形成におけるPDGFRb⁺ BMSCの機能を調べるため、Pdgfrb-Cre^ERT2 R26-DTAマウスにタモキシフェンを投与することでこの細胞集団を除去したところ、大腿骨長の短縮や骨幹端におけるCD31^hiEmcn^hiのH型血管、Osx⁺骨芽前駆細胞が著しく減少し、海綿骨量と皮質骨厚の顕著な低下が観察された。また、AP-1ファミリー転写因子JunBは脂肪細胞や骨芽細胞分化を制御することが知られており、mpMSCで高発現していたことから、Pdgfrb-Cre^ERT2 Junb^flox/floxマウスにタモキシフェンを投与し解析したところ、骨幹端H型血管柱や、PDGFRa⁺およびPDGFRb⁺細胞数、Osx⁺骨芽前駆細胞が大幅に減少していた一方、ペリリピン陽性脂肪細胞数は増加していた。これらの結果からBMSCの運命はPDGFRbシグナルと転写因子JunBによって制御されていることが明らかになった。

POINT!

加齢は血管疾患のリスクファクターとして確立されているが、加齢に伴う血管機能の低下自体が臓器の生理機能に影響を及ぼす可能性がある。本研究で著者らは、加齢に伴うVEGFシグナル伝達不全がデコイ受容体sFlt1の主に大動脈、肝中心静脈、肝類洞内皮、筋毛細血管における産生増加によって引き起こされ、複数の器官において老化を促進する可能性があることを明らかにした。著者らはLAP-tTA TRE-VEGF-A₁₆₄およびCdh5-tTA TRE-sFlt1のそれぞれの2重Tgマウスを作製し、テトラサイクリン投与を中止することにより肝細胞からのVEGF、および血管内皮細胞からのsFlt1が血流を介して末梢組織に供給されるマウス（VEGFマウスおよびsFlt1マウス）を用いた。これらマウスの肝臓、筋肉、褐色および白色脂肪組織における微小血管密度を調べたところ、24ヶ月齢のマウスで観察された微小血管希薄化が、VEGFマウスでは顕著に抑制されていた一方、sFlt1マウスでは促進されていることが示された。さらに、VEGFマウスは雌雄ともに生存期間の中央値や最大寿命が長く、その生存曲線から健康寿命が延びている可能性が示唆された。これらのマウスにおける健康的な加齢は、炭水化物利用率が有意に高く、褐色脂肪組織およびベージュ脂肪細胞が維持されることによる代謝および体組成が若齢時に近いことや、脂肪肝、筋細胞の核が中心部に局在する老化に特徴的な現象やミトコンドリア数の低下によるサルコペニア、骨量減少や後弯症、inflammaging、腫瘍の増加などの加齢に伴う病理がすべて改善されていたことで証明された。また、VEGFマウスの代謝表現型はアデノ随伴ウイルスを用いたVEGF-A₁₆₄の過剰発現マウスでも同様に観察された。これらの結果は、マウスにおいてVEGFシグナル不全が臓器老化に影響し、この経路を調節することで哺乳類の寿命を延ばし、全身の健康状態が改善される可能性を示唆している。

POINT!

髄膜(meninges)は中枢神経系を包む膜状の構造物であり、髄膜中には中枢神経系の免疫監視を司る多様な免疫細胞集団が含まれている。しかしながら、髄膜中の免疫細胞の由来に関しては未だ不明な点が多い。本論文で著者らは、パラバイオーシス、頭蓋骨の部分移植、ケモカイン受容体アンタゴニストの頭蓋骨髄への局所投与などの実験系を用いて、髄膜に存在するミエロイド系細胞は、血液ではなく隣接する頭蓋骨や椎骨の骨髄から直接的に供給されることを示した。脊髄損傷や神経炎症などの炎症条件下でも、中枢神経系に浸潤するミエロイド系細胞は近接骨髄に由来し、血中のミエロイド系細胞とは異なる遺伝子発現パターンを示していた。本研究のデータは、中枢神経系の傷害や自己免疫疾患の際に浸潤する免疫細胞の起源および侵入ルートの再考を促し、髄膜あるいは頭蓋・脊椎骨髄の免疫細胞を標的とした新規治療法の確立を目指す上で重要な知見と考えられる。

POINT!

自己免疫疾患や自己炎症性疾患を含めた免疫関連疾患において、これまでゲノムワイド関連解析(GWAS)で疾患の発症と関わる多くの遺伝子多型が同定されてきたが、それらの遺伝子多型が発症に関わるメカニズムは明らかにされていなかった。今回筆者らは健常人と10種の免疫関連疾患患者の計416例を対象とし、末梢血中の免疫細胞を28サブセットに分類した大規模な免疫細胞の遺伝子発現解析と全ゲノム配列解析を行なった。このデータセットは過去のeQTL研究で得られた結果と高い一致率を示しただけでなく、既報のGWASと組み合わせることにより、各疾患の発症と関わる免疫細胞種を同定できたり、偽陽性を多く含むeQTL variantからさらに真のvariant候補を抽出したり(fine mapping)、plasmablastやpDCなどのminor populationにおいても免疫細胞特異的な遺伝子多型を検出したりすることができた。既存のデータベースと比較しても大規模かつ極めて詳細であり、さらに欧米における遺伝子多型解析が多かった中でアジア人種の日本人のデータが示されたことも特筆に値する。本データはImmunexUTにてウェブ上に公開されており、今後多くの免疫研究者にとって非常に有用なデータベースとなることであろう。

POINT!

がんの転移において、臨床的に転移が診断される以前から遠隔臓器の微小環境の変化が起こることが知られている。この特殊な微小環境は前転移ニッチと呼ばれ、原発巣由来の液性因子や細胞外小胞の作用により、間質細胞の活性化、フィブロネクチン産生及びケモカイン分泌の増加、骨髄由来細胞の集積などが引き起こされ、転移がん細胞が生着・増殖しやすい環境が構築されている。そのため、前転移ニッチの制御によりがんの転移を抑制できる可能性が示唆されている。筆者らは、まずマウス横紋筋肉腫細胞M3-9-Mの同所性移植モデルを用いて肺の前転移ニッチにおける免疫細胞の網羅的解析を行なった。このモデルでは、移植後22日でがん細胞の肺への転移が確認されるため、移植後5~20日を「前転移」と定義した。がん細胞移植後15日以降において、移植マウスの肺では単球、マクロファージ、顆粒球、樹状細胞などのミエロイド系細胞が増加し、CD4⁺T細胞が有意に減少していることが明らかになった。また、移植から15日後の肺の網羅的遺伝子発現解析において、T細胞性免疫の抑制、ミエロイド細胞の活性化、免疫抑制性ミエロイドマーカーの上昇などがみられた。この結果から、前転移ニッチに集積するミエロイド細胞を標的とすることで、抑制的な免疫微小環境を調整することが可能ではないかと考えた。筆者らは、マウス骨髄細胞由来造血幹細胞・前駆細胞(HSPCs)にIL-12遺伝子を導入し、IL-12分泌ミエロイド細胞を作製した(IL12-GEMy)。M3-9-M移植から12日後にIL12-GEMyを静脈内投与したところ、肺に集積するCD4⁺およびCD8⁺T細胞の数が有意に増加した。また、IL12-GEMy投与から3日後の肺の網羅的遺伝子発現解析において、T細胞性免疫の活性化およびミエロイド細胞の抑制がみられた。さらに、がん細胞移植後22日における肺転移が有意に減少し、生存期間の延長が示された。抗原特異的T細胞移植療法または抗癌剤投与療法との併用療法を検証したところ、IL12-GEMy投与はそれらの治療の効果を増強することも明らかになった。筆者らは、遺伝子編集ミエロイド細胞の投与により前転移ニッチの免疫微小環境を調整し、がん転移を抑制するという新たな治療法の可能性を提示した。

POINT!

損傷を受けた組織の修復は、好中球・単球等が異物除去を行うphase(炎症期)と、それに引き続いて組織をリモデリングするphase(組織修復期)から構成され、この両者のバランスは効果的な創傷治癒に重要である。人工膝関節全置換術後の重要な合併症の一つである関節線維症はこのバランスが破綻した状態と考えられているが、関節線維症の詳細な病態は明らかになっていない。そこで、筆者らは関節線維症の病態を明らかにすべく、脛骨にインプラントを挿入したマウスを用いて、関節組織内および所属リンパ節内における炎症反応の変化を解析した。その結果、インプラント挿入後、関節内では、まずIL-6やStat3等による急性期反応が惹起された後、一般的な創傷治癒で観察されるMacrophage type2 (M2)の活性化を介した組織修復がおきるのではなく、IFN-STAT-IRF signal pathway→NFκB/IL-1/PGE2 signal pathway→TGFβ/PDGF signal pathwayという独特な経路を介した組織修復がおきることを発見した。IFN系の発現が誘導される点が特徴的であり、IFNはIL-1やPGE2の繊維化促進を抑制しているものと考えられる。なお、後期(繊維化期)にはHOTAIR制御経路が活性化していることも特徴的で、このことはPRC2およびLSD1阻害剤が関節の線維化を予防に有用である可能性を示した。

POINT!

ストレスによって誘導される細胞老化は腫瘍抑制性であると考えられてきたが、近年では腫瘍促進の一面もあることが報告されている。本論文ではRANKが乳腺上皮の細胞老化を誘導し、腫瘍の発生を遅延させるが結果的には悪性度を増強させていることを示している。筆者らは、乳がん自然発症モデル(Neu^+/- or  PyMT^+/- background)において、RANKを過剰発現しているマウス(RANK^+/tg)では乳腺上皮の細胞老化が誘導されること、また乳がんの発症が遅延することを発見した。これを裏付けるためにRANK ligandの投与によって乳腺上皮の細胞老化が誘導されることをin vivo, in vitro両方の系で確認した。さらに、このRANK誘導性の細胞老化がp16/p19を介していることをRANK^+/tg; p16/p19^-/-マウスを用いて証明した。RANK^+/tgマウスでの細胞老化はRANKを高発現している管腔細胞に限定される一方で幹細胞性は基底細胞と管腔細胞両方に認めることがRNA-seqの解析で示された。これは老化細胞からAutocrineまたはParacrineの機序で幹細胞性が誘導されるためと考えられる。Navitoclax(老化細胞除去薬剤)を使用するとRANK誘導性の老化細胞は消失し、さらに幹細胞性を示すMammosphereの形成も著減することが示された。これらのことからRANKに誘導される細胞老化は幹細胞性の形成に必須であることが示唆された。以上の結果よりRANKが乳がんの幹細胞性を増強することが予想された。実際にRANK^+/tgマウスでは乳がんの進展が早く、肺転移も起こりやすいことが証明された。公開されているヒト乳がんのデータベース（TCGA dataset）を解析したところ、乳がん細胞(luminal subtype)のRANK発現と細胞老化関連遺伝子発現との間に相関を認めた。したがって臨床的にもRANKの発現と細胞老化と幹細胞性には関連があることが示唆された。本論文はRANKシグナルによる乳腺発達、がん発生、がん転移に新たな知見を加えるものであり、がんの予防や治療につながる可能性がある。

POINT!

セレノシステインの形でをセレンを含んでいるセレノプロテインは骨リモデリングに重要であるがそのメカニズムの詳細は不明であった。RANKL誘導性破骨細胞のGeneChip解析を行いセレノプロテインW（SELENOW）を同定した。筆者らは破骨細胞前駆細胞にSELENOWが発現しているが、RANKLによる刺激後に発現が低下することを見出した。SELENOWのノックアウトマウスおよびLysM-Creによってマクロファージ系列特異的にSELENOWを特異的に欠失させたマウスでは破骨細胞分化が阻害され骨量が増加した一方で、SELENOWを高発現させたマウスでは破骨細胞分化が亢進し骨粗鬆症の表現型を示した。いずれのマウスでも骨芽細胞数はコントロールと変わらなかった。構成的にSELENOWを発現させると、破骨細胞の骨吸収活性は上昇しアポトーシスは抑制された。さらに破骨細胞成熟のために重要な細胞融合を刺激した。これらの結果により、RANKL刺激後に観察されるSELENOWの発現減少は、破骨細胞が過剰に活性化することを防ぎ、骨粗鬆症を抑えていると考えられる。彼らの報告により、セレンが骨代謝に重要な役割を果たすことがわかった。

POINT!

IL-17Aは、感染防御を担うサイトカインであるが、破骨細胞分化を促進する作用もあるため、歯周炎においては病態の改善と悪化の両方に関与しうる。著者らは、歯周炎に対する抗IL-17A療法の有効性を検討した。マウス臼歯の絹糸結紮モデルに対して、乳酸-グリコール酸共重合体の微小粒子 (PLGA-MP) を用いた抗IL-17A抗体 (抗IL-17A MP) の歯周組織局所への持続的なドラッグデリバリーを行なった。歯周炎の誘導に伴い組織中のIl17a発現は上昇するが、抗IL-17A MP投与によって抗体の血中濃度は持続的に上昇したため、治療効果が期待された。このマウスの歯槽骨をμCTにて評価したところ、対照群と比較して有意に骨吸収が抑制された。また、組織学的解析の結果、歯槽骨における破骨細胞の形成も抑制されていた。歯周炎局所の遺伝子発現解析の結果、抗IL-17A MP投与により歯周炎誘導後早期のIl6発現が抑制された。細菌学的な解析はなされていないものの、歯周炎に対する抗IL-17A療法の有効性が示唆された。

POINT!

未成熟な個体を守り育てる育児行動は、時として親個体の生存に不利に働くことがある。種の保存のためには、そういった危険な状況でも子育ての意欲を失わない必要がある。母性行動には内側視索前野 (cMPOA) が重要であることが分かっている。著者らは、育児行動中の母マウスの脳組織を詳細に観察し、cMPOAおよび前交連核 (ACN) でカルシトニン受容体 (Calcr) 陽性細胞が活性化することを発見した。ウイルスベクターを用いた神経細胞の標識によって、Calcr陽性cMPOAニューロンへの投射経路が処女マウスと母マウスでは大きく異なり、後者では側坐核からの入力が多いことがわかった。また、Calcr陽性cMPOAニューロンは処女マウスでは主にグルタミン作動性である一方、母マウスではGABA作動性であるなど、このニューロンの性質は出産に伴い大きく変わることが見出された。このニューロンの育児行動における機能を明らかにするために、Calcr–CreマウスのcMPOAにCre依存的にテタヌス毒素を発現するウイルスベクターを投与した。これらのマウスは産仔数に異常はないものの、育児行動に異常をきたしたため仔の生存率が低下した。DREADD法により育児未経験のオスのマウスのCalcr陽性cMPOAニューロンを活性化した際には同居させた仔マウスの食殺が減少した。Calcrは、カルシトニン以外にもCGRPファミリー分子を結合することが知られている。脳内ではカルシトニンが発現せず、他の部位で産生されたカルシトニンが血液脳関門を超えて脳に移行することはできないため、脳内にカルシトニン以外のCalcrリガンドが存在すると考え、探索を行なった。その結果、MPOAにおいてCalcr陽性ニューロンとは異なるニューロンが、Calcrリガンドの一つamylinを発現することを見出した。Amylinの遺伝子発現は周産期に増加し、amylin陽性ニューロンは仔マウスとの接触によってエストロゲンおよびプロラクチン依存的に活性化した。Amylin欠損マウスは正常に妊娠、出産、育児を行なったが、高架式十字迷路を利用した危険な状況でのレトリービング実験ではレトリービング行動に変化が見られた。以上より、視床下部におけるカルシトニン受容体シグナルは強いストレス下での育児行動を制御することが明らかになった。

POINT!

骨形成不全症は、骨基質分子であるコラーゲン線維の合成に異常が起こる骨系統疾患である。現在、臨床的には21の病型に分類されているが、近年18型骨形成不全症の原因遺伝子としてTENT5Aが発見された。同じTENT5ファミリー分子のTENT5Cについては、ポリアデニル化を介したmRNAの安定化が報告されているものの、TENT5Aの機能は不明である。そこで、著者らはTent5a欠損マウスを作出・解析した。このマウスの体長は短く、骨や軟骨の低形成、肋骨の自然骨折が見られた。TENT5Aのレポーターマウスを作出したところ、骨芽細胞で高い発現を認めたため、この分子の骨芽細胞における機能の解析を行なった。Tent5a欠損骨芽細胞では、分化や石灰化の低下が見られた。また、DirectRNA sequencing (DRS) 法により、骨基質分子の合成に関わる遺伝子のpolyA長の短縮が認められた。組織学的解析により、Tent5a欠損マウスでは、コラーゲン原線維の形成不全が認められた。TENT5Aの指向性を解析したところ、比較的短くGCリッチで3’UTRが短いmRNAが標的となる傾向が見出された。以上より、18型骨形成不全症の原因遺伝子TENT5Aの機能が明らかになった。

POINT!

近年の研究の結果、多くの転移が他の転移巣からのさらなる転移によって開始されることが示唆されていたが、そのメカニズムは解明されていなかった。著者らは選択的に後肢の骨に転移させる方法としてMDA-MB231、MCF7、PC3などのがん細胞を外腸骨動脈へ注入する方法と、先に静脈から全身へ回る外腸骨静脈へ注入する方法などを比較し、骨転移からの二次転移はより早く、広範囲に他臓器へ転移する能力が高まる可能性を示した。この現象をさらに確認するため、ドキシサイクリンによって誘導されるCas9によりランダムな遺伝子変異をgRNAに蓄積させ、遺伝子バーコードとして解析可能なシステムを導入して乳腺脂肪体に移植し、腫瘍が1 cm³に達した時点で切除し、ドキシサイクリンでCas9発現を誘導した。この方法によって転移を追跡し、原発巣、骨髄、他臓器でのクローン多様性を調べたところ、ほとんどの転移はマルチクローナルであり、骨の微小環境が乳がんや前立腺がんの細胞をさらに転移させ、他の遠隔臓器への二次転移を引き起こすことが示された。さらに著者らはMDA-MB-231細胞由来クローンで非転移性のSCP21細胞を用い、乳腺脂肪体、肺、後肢骨に注入し腫瘍を形成させた。6週間後、これらの臓器からがん細胞を採取して左心室に注入すると、骨微小環境に置かれたSCP21細胞は遠隔臓器でのコロニー形成能が高く、複数の部位に非常に大きな腫瘍を形成することが示された。著者らの研究で骨微小環境のがん細胞でのヒストンメチル基転移酵素EZH2の重要性が明らかにされていることから、この分子に着目した。骨微小環境に置かれたSCP21細胞と他の細胞を比較したところ、骨に取り込まれた細胞ではEZH2活性が高く、骨微小環境に置かれたSCP21細胞を左心室注入前にEZH2阻害剤EPZ011989で一時的にin vitroで処理すると、転移の促進能が顕著に低下した。さらに誘導性にEZH2がノックダウン可能なMDA-MB-231細胞を作製し骨に注入後EZH2をノックダウンすると、骨での増殖には変化がなかった一方、他臓器への二次転移を減少させた。以上から、本研究は骨微小環境が転移の進展に果たす役割を明らかにするとともに、多臓器転移を引き起こすエピジェネティックなリプログラミングの過程を解明した。

POINT!

骨細胞は骨格を制御する重要な細胞である。著者らは、この複雑な細胞ネットワークを制御する遺伝子と分子プログラムを明らかにするために、マウス骨細胞のトランスクリプトーム解析を行った。4、10、16、26週齢のオスおよびメスマウス上腕骨のRNA-seq解析を行ったところ、骨細胞が積極的に発現する遺伝子の総数は骨格の成熟に伴って増加し、81％の遺伝子が雌雄の全ての週齢で共通して発現していた。週齢間での遺伝子発現の比較から、成長期に発現する骨細胞のトランスクリプトームは成体骨格とは異なることが示された。また、雌雄間では成熟した骨格では違いが観察されたが、4週齢および10週齢では有意な違いはなかった。次に、骨髄や骨ライニング細胞を除去した骨とそれらを残した骨とを比較・解析し、1777遺伝子を同定した。さらに、骨髄や血液、筋肉などで発現する538遺伝子を除外し、骨細胞で有意に発現する1239遺伝子を他の細胞と区別する骨細胞トランスクリプトームシグネチャーとして定義した。これらには、Sost、Dkk1、Mepe、Dmp1、Tnfrsf11b、Wnt1、Fgf9、Irx5など、骨格での機能が確立されている遺伝子が含まれていた。また、Tnfsf11は骨細胞で発現はしていたが、骨細胞トランスクリプトームシグネチャーには含まれていなかった。さらに、これらのうち78％はこれまでに骨格における役割が示されておらず、細胞間神経ネットワークの形成を制御する遺伝子が豊富に含まれていた。また、骨細胞トランスクリプトームシグネチャー遺伝子が骨格において機能的な役割を果たしているかどうかを確認するために、OBCDデータベースで骨格表現型が解析された733のノックアウトマウス系統のうち、64の骨細胞トランスクリプトームシグネチャー遺伝子ノックアウトマウスを調べたところ、Daam2などの機能既知遺伝子や、Auts2、Dact3、Ldlrad4などの骨における機能が報告されていない遺伝子を含む26系統で（41％）で骨格の構造的もしくは機能的な表現型が確認された。最後に著者らは、骨細胞トランスクリプトームシグネチャー遺伝子とヒト疾患の関係性を検討したところ、骨形成不全症などの単一遺伝子性の骨格疾患を引き起こすヒトオルソログが多く含まれることや、多遺伝子性疾患である骨粗鬆症や変形性関節症と関連していることがわかった。以上の結果から、本研究は骨細胞のネットワークと機能を制御する分子プログラムの全体像を明らかにし、ヒト骨格疾患における骨細胞の重要性が証明された。

POINT!

男性不妊の原因となる精子濃度の低下、運動性の低下、精子形態の異常などのメカニズムは完全には解明されてはいないが、セルトリ細胞の機能が重要な役割を果たす。Runx2やOsterix、オステオカルシンは精巣でも発現していることから、骨関連分子の中には性腺で局所的に作用し、精巣機能に影響を与えるものがあることが示唆されていた。本研究で著者らは、マウスとヒトの精巣においてRANKLシグナルが活性化していることを明らかにした。RANKL発現はセルトリ細胞や一部の精母細胞、精子細胞にみられ、RANKは生殖細胞に発現しており、精原細胞と精子細胞で最も顕著に発現していた。一方、OPGは精原細胞、一部の精細管周囲細胞、精細管周囲細胞と精原細胞の境界、多くの精母細胞と精子細胞で発現していた。また、精巣では可溶型RANKL（sRANKL）と膜型RANKLがともに発現していた。マウスにOPGを投与すると精巣重量および精子数が一時的に増加し、RANKLを全身またはセルトリ細胞特異的に欠損したマウスでは、コントロールマウスと比較して精子数が多く、雄性生殖能力が高かった。ヒト精液中のsRANKL濃度は血清中と比較して100倍程度高く、さらに不妊男性は健常男性よりも精液中sRANKL濃度が高く、血清中sRANKL濃度は低かった。精液中sRANKL濃度は、全精子数よりも高い特異性で健常男性と不妊男性を区別することができる可能性が示された。不妊男性にデノスマブを1回投与すると、精液中sRANKL濃度が低下し、血中インヒビンBおよび抗ミューラー管ホルモン濃度が上昇したが、総精子数や精子濃度などには変化がみとめられなかった。一方で、前進運動能をもつ精子数は一部のグループ（投与前の血中OPG濃度が高いグループ）でのみ上昇することが明らかにされた。以上から、RANKLシグナルは精液の質や男性の生殖能力に影響を及ぼす男性生殖機能の調節因子であることが示唆された。

POINT!

関節リウマチでは関節破壊だけでなく、炎症関節の近傍や全身性の骨粗鬆症も誘導される。傍関節性骨粗鬆症は関節の臨床所見が現れる前に発症するがそのメカニズムは不明な点が多い。筆者らは炎症関節近傍の骨の骨髄に存在する抗体を産生する形質細胞が高いRANKLを発現しており、B細胞と比較して強力な破骨細胞誘導能をもつことを見出した。また関節の腫脹に先立って傍関節骨粗鬆症の発症とともに炎症関節近傍の骨の骨髄中の形質細胞の細胞数の増加が認められた。さらにコラーゲン誘導性関節炎感受性のDBA1/J背景のB細胞系列特異的RANKL欠損マウスを樹立し、B細胞系列由来のRANKLが傍関節性骨粗鬆症をひきおこすことを明らかにした。関節においては滑膜線維芽細胞が主要なRANKL 発現細胞として関節破壊に関わることを生体レベルで実証することに成功した。本研究により関節リウマチにおける傍関節性骨粗鬆症の新しいメカニズムを解明するとともに形質細胞が治療標的になりうることが示された。

POINT!

レプチン受容体（LEPR）を発現する成獣骨髄のストローマ細胞は、造血幹細胞および早期の血球系前駆細胞を維持するための、幹細胞因子（SCF）を含む成長因子の重要な供給源だと知られている。LEPR⁺細胞は、骨格幹細胞や骨形成および脂肪生成前駆細胞を含む不均一だが、これらのサブセットを区別したり、それらの機能を比較したりするために利用できるマーカーがほとんどないという問題がある。筆者らは、細動脈周囲LEPR⁺細胞の一部にオステオレクチンが発現しており、オステオレクチン陽性LEPR⁺細胞は骨形成の前駆細胞を、オステオレクチン陰性LEPR⁺細胞は脂肪細胞の前駆細胞を多く含むことを示した。また、この細動脈周囲オステオレクチン陽性細胞は加齢とともに減少することもわかった。成獣マウスにおいて誘導的にオステオレクチン陽性細胞特異的にSCFを欠損させる（Oln^iCreER/+; Scf^fl/flマウス）と、造血幹細胞や大部分の前駆細胞の維持には影響しなかったが、リンパ球共通前駆細胞の割合が減少し、リンパ球形成、細菌クリアランス、および急性細菌感染後の生存率が低下することがわかった。興味深いことに細動脈周囲のオステオレクチン陽性細胞とリンパ球共通前駆細胞の割合は自発走運動で増加したが、尾部懸垂による後肢非荷重では減少した。筆者たちはオステオレクチン陽性細胞特異的に機械感受性イオンチャネルPIEZO1を欠失させる（Oln^mT/iCreER;Piezo1^fl/flマウス）と、オステオレクチン陽性細胞およびリンパ球共通前駆細胞が共に減少することを示し、細動脈周囲のオステオレクチン陽性細胞の維持には機械的刺激が必要であると報告した。このOln^mT/iCreER;Piezo1^fl/flマウスは感染時の細菌クリアランス能もコントロールと比べて低下していた。以上のように、骨髄の骨形成およびリンパ球形成のための動脈周囲のニッチは機械的刺激によって維持されており、加齢に伴い減っていくことが報告された。

POINT!

関節リウマチ患者の滑膜では、マクロファージおよび破骨細胞のアポトーシスが抑制されており、そのことが持続的な炎症・骨破壊に寄与していることが知られている。本研究では、アポトーシスを誘発する薬剤であるcelastrol(CEL)を、これらの細胞特異的にdeliverする方法を見出した。著者らは、drug deliveryのための担体として既に広く使用されているPLGA nano particle (NPs)にCELを付与し (CEL-NPs)、PEG鎖とRGD配列を付加した。さらにoff targetな作用を減らすため、PEG鎖にMMP9 cleavable peptideを挿入し、MMP9存在下でPEG鎖が切断されることで、RGD配列が露出し、マクロファージおよび破骨細胞表面に発現するαvβ3インテグリンを介して細胞内に取り込まれるような酵素反応性のnano particle(CEL-PRNPs)を作製した。筆者らはまず、CEL-PRNPsがin vitroにおいて、RA患者PBMCs・ラットBMCs由来のLPS刺激活性化マクロファージおよび破骨細胞に効果的に取り込まれ、これらのアポトーシスを促進することを確認した。次に、AIAラットでの投与実験を実施し、CEL-PRNPsが肝臓や脾臓等の他臓器のマクロファージを障害することなく、関節炎症部位のマクロファージおよび破骨細胞のみにアポトーシスが誘導することで、炎症を軽減することを証明した。驚くべきことに、骨破壊が既に進行した関節炎発症後期(関節炎誘発17日後)からCEL-PRNPsを投与開始した実験では、炎症改善はもちろん、健常関節と比較して遜色ない程度に骨・軟骨再生がしていた。以上から、CEL-PRNPsによる関節リウマチ滑膜中のマクロファージ・破骨細胞特異的なアポトーシスの誘導は、進行した炎症性関節炎の炎症寛解のみならず、骨・軟骨の修復、二次性骨粗鬆症の予防にもつながることが示唆された。

POINT!

腸は外界からのバリア機能を維持しつつも栄養素を取り込む機能をもつ。小腸における、栄養取り込みがどのように制御されているのかを検証するため、筆者らは、主要栄養素の配合比率が異なる餌をマウスに給餌し、腸管上皮細胞の遺伝子発現変化を解析した。炭水化物を多量に含む餌を与えた結果、これらを消化する酵素群やトランスポーターの遺伝子発現が上昇した。このような”on demand”な遺伝子発現制御は、gdT細胞が3型自然リンパ球から産生されるIL-22の発現を抑制することで制御されていることが示された。また、gdT細胞の局在と遺伝子発現は腸の栄養状態によって変化することも示された。さらに、餌に含まれる栄養素によって、腸管上皮を構成する細胞群のリモデリングが生じることがわかった。以上の結果より、gdT細胞が栄養状態の感知に関与することを同定した。

POINT!

IL-17 familyは生体防御や自己免疫疾患の発症に関与することが知られているが、IL-17Dに関しては理解が少ない。筆者らは腸管上皮由来のIL-17Dが3型自然リンパ球(ILC3: group3 innate lymphoid cell)の機能を制御し、腸管恒常性を維持していることをこの論文で示した。まず、筆者らは全身の臓器のIl17dの発現を Real-time RT-PCR法で評価し、大腸で特に発現が高いことを見出した。次にIl17d欠損マウスではDSS誘導性大腸炎が悪化することを示した。また大腸炎モデルでは血球系細胞ではなく、腸管上皮細胞がIL-17Dを産生していることがわかった。さらにIl17d欠損マウスでは大腸におけるIl22や抗菌ペプチドであるReg3b, Reg3gの発現が低下していた。一方、IL-17Dの投与はIl17d欠損マウスの大腸炎の症状が改善させた。さらにIl17d欠損マウスでは粘膜固有層に存在するIL-22産生をするILC3が減少していることを示した。便中の16S rRNA sequencingの結果から、Il17d欠損マウスでは腸内細菌叢の多様性が減少していることが示唆された。筆者らはタンパク精製手法を駆使して既知のIL-17受容体ではなく、成熟したILC3表面に発現する糖タンパク、CD93がIL-17Dの受容体であることを証明した。最後に筆者らはILC3特異的Cd93欠損マウス（Rorc^creCd93^flox/flox）ではIl17d欠損マウス同様にIL-22産生が低下し大腸炎が増悪することを示した。以上よりIL-17D-CD93 axisはILC3の機能を制御し腸管恒常性を維持することが判明した。

POINT!

破骨細胞は、単球・マクロファージ由来の前駆細胞が融合して形成される大型で多核の細胞で、骨吸収が完了するとアポトーシスを起こすと考えられていた。本研究で著者らはLysMCre/+ tdTomatoLSL/LSLとBlimp1Egfp/+ Rag1–/–もしくはCsf1rEgfp/+マウス由来骨髄細胞を混合した骨髄キメラマウスを作製し、脛骨の生体内イメージングを行った。EGFP+tdTomato+の破骨細胞は骨内膜上の多核巨大細胞で、蛍光ラベルされたビスホスホネート取り込み能を有し、多数の細胞突起により近傍細胞と相互作用する細胞として観察された。可溶型RANKL投与によって破骨細胞を活性化すると運動性が上昇し、投与後20分以内に細胞突起が消失してさらに細胞融合が誘導された。また、長時間の観察で巨大な破骨細胞が運動性を有する小さな娘細胞に分裂する様子が観察された。これらの娘細胞は、驚くべきことに元の破骨細胞から離れて移動するだけでなく、隣接する破骨細胞と再度融合し、場合によっては娘細胞同士が融合することも観察されたことから、この現象はアポトーシスとは異なることが示され、著者らはこの破骨細胞からの分裂によって生じた娘細胞をosteomorphと名付けた。OPG-FcによるRANKL阻害はこの細胞リサイクルを阻害し、osteomorphの蓄積に至った。シングルセルRNA-seq解析の結果、osteomorphは破骨細胞やマクロファージとはmRNAレベルで異なる細胞状態であり、多くのnon-canonicalな破骨細胞遺伝子を発現していることがわかった。これらの遺伝子のうち、40遺伝子のそれぞれのノックアウトマウスを解析したところ、17のノックアウトマウスで骨の表現型が観察された。さらに、ヒトにおけるosteomorph遺伝子の一部の変異は単一遺伝子性の骨格障害を引き起こし、また骨密度と関連していることも明らかにされた。以上から、破骨細胞は骨吸収制御に関わる新たな細胞状態であるosteomorphを介してリサイクルされ、骨格疾患の治療の標的となる可能性が示された。

POINT!

骨細胞は骨に最も多く存在する細胞であり、造血の重要な制御因子として注目されているが、好中球の形成における骨細胞の役割とそのメカニズムは不明であった。Dmp1-Creを用いて骨細胞におけるTsc1を欠損させることでmTORC1シグナルを恒常的に活性化させたマウスでは前骨髄球・骨髄球の増殖が観察された。一方、骨細胞でRhebを欠損させることでmTORC1を不活性化させたマウスでは好中球数が減少した。著者らはRNA-seq解析によって好中球形成を活性化する骨細胞由来分子としてIL–19を同定した。実際に、mTORC1活性化マウスではNF-kBの活性化を介してIL–19発現が劇的に上昇し、免疫染色などにより骨細胞が主な産生源であることを見出した。好中球はその前駆細胞段階からIL–19受容体であるIL–20Rbを発現しており、IL–19はこの受容体からSTAT3を活性化してその増殖と好中球形成を促進した。さらに、IL–19の投与により好中球分化を促進できる一方、IL–19に対する中和抗体投与やIL–20Rbに対するsiRNAの骨髄腔への投与により、好中球形成が抑制されることも示された。重要なことに、低用量のIL–19投与はG–CSFよりも効率よく化学療法（シタラビン）、放射線照射、クロラムフェニコールによる好中球減少症を回復させた。以上の結果から、IL–19は好中球の発生に重要な役割を担っており、好中球減少症治療のための強力なサイトカインである可能性が示唆された。

POINT!

JAK2はサイトカインや成長因子のシグナル伝達に重要な役割を果たしているが、その破骨細胞における役割はいまだ不明であった。著者らは、破骨細胞におけるJAK2の役割を明らかにするため、CtskCreマウスを用いて破骨細胞特異的JAK2欠損（Oc-JAK2–KO）マウスを作製した。Oc-JAK2–KOマウスは出生後に著しい成長障害を示したが、骨密度や骨構造、骨強度にはあまり変化がなかったことから、成長障害は通常の破骨細胞機能異常によるものではない可能性が示された。JAK2はIGF1発現制御因子として知られていることからIGF1発現を調べたところ、Oc-JAK2–KOマウスでは破骨細胞特異的なIGF1の発現が低下しており、身体のサイズ決定に破骨細胞由来IGF1が関与している可能性が示唆された。破骨細胞由来のIGF1の役割を直接評価するために、破骨細胞特異的なIGF1欠損マウスを作製したところ、Oc-JAK2–KOマウスと同様の成長障害を示した。さらに、TtrプロモーターによりヒトIGF1を過剰発現させると、Oc-JAK2–KOマウスの成長障害が回復した。以上の結果から、破骨細胞におけるJAK2とIGF1は破骨細胞の骨吸収機能とは独立して、身体サイズの決定に役割を果たしている可能性が示された。

POINT!

破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成は、骨代謝において密接に関連している。骨同化作用を有するPTHは、骨吸収優位の状態から骨形成優位の状態へとバランスを変化させるが、この過程がPTHによってどのように協調的に調整されているかは不明であった。本研究で著者らは、PTH投与後にCol2.3-ECFPマウスからソートした骨芽細胞における遺伝子発現の網羅的解析を行い、セリンプロテアーゼ阻害剤であるSLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) が、PTHによる骨量上昇に関わる重要な因子であることを同定した。SlpiはPTHによって骨芽細胞で強く発現し、Slpi欠損マウスではPTH間欠投与による骨形成促進効果が著しく阻害され、骨吸収が上昇した。Slpiを過剰発現する骨芽細胞は分化能が上昇し、Slpi過剰発現細胞で発現変化するタンパク質の質量分析法による網羅的解析によってSLPIによる分化促進は-cateninを介している可能性が示唆された。SLPIの骨吸収に対する影響は直接的な作用ではなく、骨芽細胞と破骨細胞の接触を促進することで骨吸収が抑制され、さらに骨形成が促進されることが示された。また、マウス頭蓋骨の生体イメージングによりCol2.3-ECFP/TRAP-tdTomatoマウスでの破骨細胞と骨芽細胞の相互作用を解析したところ、Slpi欠損によりPTH投与下で促進される骨芽細胞と破骨細胞の細胞間相互作用が阻害された。以上の結果から、SLPIは骨芽細胞と破骨細胞のコミュニケーションを制御し、PTHによる骨同化作用を促進することが明らかになった。

POINT!

骨髄異形成症候群(MDS)は、増血の異常により貧血、出血傾向、易感染など様々な症状を呈する疾患である。貧血は5番染色体長腕の欠失との関連が古くから知られている。Gene Expression Commons (https://gexc.riken.jp) を用いた遺伝子発現のデータベース解析の結果、5q15に位置するセリン-スレオニンキナーゼRight open-reading-frame kinase 2 (RIOK2) が幼弱な赤芽球コロニーで高い発現を認めた。そこで、Riok2^f/+Vav1^creマウスを作出したところ、これらのマウスではRBC、Hb、HCTの低下といった貧血所見が認められた。赤血球分化(RI〜RIV)の解析の結果、アポトーシス増加を伴う各段階の前駆細胞の減少を認めた。フェニルヒドラジン誘導性の溶血による赤血球新生を誘導するモデルにより、RIOK2のストレス下での造血能への寄与を検討した。Riok2^f/+Vav1^creマウスでは対照群のマウスと比較してRIIIおよびRIV赤芽球の減少に経発する高度の貧血と回復の遅延が認められた。したがって、RIOK2は赤血球分化を制御することが示された。RIOK2の作用機序を解明するためにマススペクトロメトリー解析を行ったところ、RIOK2欠損細胞ではS100A8、S100A9、CAMP、NGPといったアラーミンの上昇が見出された他、免疫応答のパスウェイ遺伝子発現にも変化が見出された。Riok2^f/+Vav1^creマウス由来のTH細胞ではIL-22産生能が上昇していた。RIOK2欠損によるIL-22産生亢進のメカニズムをRNA-Seq法により解析し、p53経路の活性化を見いだした。ChIP法によりp53のIl22プロモーターへの結合が示された。P53遺伝子(Trp53)の欠損により、Riok2欠損によるIL-22産生亢進はキャンセルされた。したがって、p53はRiok2によるIL-22産生制御仲介することが明らかになった。Riok2^f/+Il22^+/−Vav1^creマウスはRiok2^f/+Il22^+/+Vav1^creマウスと比べ末梢血中のRBC、Hb、HCTが高値であり、RIOK2欠損による貧血はIL-22を介することがわかった。赤血球前駆細胞がIL-22受容体(IL-22RA1)を発現すること、IL-22の中和抗体投与やIL-22RA1欠損によってIL-22の作用が消失することから、IL-22はサイトカイン作用によって赤血球前駆細胞を標的とし、貧血を誘導することが示された。貧血は慢性腎疾患(CKD)の主症状の一つであるが、CKD患者の血清においてIL-22が高い値を示したことから、IL-22はMDSのような遺伝子変異以外の要因で生じる貧血にも関係する可能性が示唆された。

POINT!

海馬の歯状回は、成体における神経新生の場であり、神経新生の活性はストレスなどによって変動しうる。グリア細胞の一つ、ミクログリアは神経系の維持に重要であるが、ストレス下での神経新生におけるミクログリアの機能には不明な点が多い。絶食、絶水、拘束などのストレッサーに暴露するモデル(chronic mild stress: CMSモデル)に対して感受性の高いマウスと低いマウスの海馬と前頭前皮質の解析により、低感受性群におけるIl4発現が認められた。In situハイブリダイゼーション法により、Il4はニューロンとミクログリアに認められた。低感受性群ではSTAT6活性化も認められたことから、IL-4シグナルがストレスに関係すると考えられた。ストレス低感受性マウスではミクログリアにおける形態変化やArg1陽性細胞の増殖も認められたことから、著者らはIL-4－ミクログリアを軸としたストレス抵抗性に着目した。アデノ随伴ウイルスによりCMSマウスの海馬でIl4を過剰発現させたところ、顕著なArg1 (M2ミクログリアマーカー)発現上昇とNos2 (iNOS遺伝子、M1ミクログリアマーカー)発現低下を認めた。組織学レベルでは、Il4過剰発現マウス海馬においてArg1陽性ミクログリアが増加し、ミクログリアは活性化していた。フローサイトメトリー解析により、同部位ではCD86およびCD206二重陽性細胞が増加していた。ミクログリアにおけるIL-4作用を解析するために、CX3CR1Cre/ERT2マウスの海馬にLoxP-CMV-EGFP-LoxP-IL4Rα-shRNAコンストラクトを有するレンチウイルスを投与し、海馬のミクログリア特異的なIL-4受容体のノックダウンを行った。その結果、これらのマウスでは、CMSモデルの実施により、Arg1陽性ミクログリアの減少を伴う鬱様行動が見られた。CMS高感受性マウスでは神経新生の低下を認めた。Il4過剰発現により神経新生に関わる遺伝子群の発現が変動し、ミクログリア特異的Il4raノックダウンにより神経新生が低下したことから、IL-4がミクログリアを介して神経新生を誘導することが示された。Il4過剰発現マウスより単離したミクログリアの培養上清を神経幹細胞に添加したところ、増殖と分化が促進された。Il4過剰発現マウスの海馬ではミクログリアによるBDNF産生が増加し、ミクログリア特異的Il4raノックダウンマウスでは低下した。BDNF受容体TrkBのシグナルをK252aで遮断したところ、IL-4による神経新生の促進効果は消失した。以上より、ストレス下において、ミクログリアはIL-4によりBDNFを産生し、神経新生を誘導することでストレスに抵抗していることが示された。

POINT!

妊娠が成功するかどうかは、免疫系の著しい変化を含む母体の適応に依存している。胸腺が妊娠中に著しく変化することは以前から知られていたが、このプロセスの分子的基盤や重要性についてはほとんど不明のままであった。本研究で著者らは、胸腺髄質上皮細胞におけるRANK発現依存的に、妊娠マウスの制御性T（T_reg）細胞が胎盤に遊走してクローン増殖し、流産を防ぐことを明らかにした。胸腺上皮細胞でRank遺伝子を欠失させると、妊娠中の雌マウスにおける胸腺の退縮が抑制され、内在性T_reg細胞の増殖が低下した。プロゲステロンは、AIRE⁺胸腺髄質上皮細胞依存的にRANKを介して胸腺T_reg細胞の発生を促進した。また、マウス胸腺上皮におけるRank欠損により胎盤中の内在性T_reg細胞の蓄積が減少し、流産の数が増加するだけでなく、内臓脂肪組織におけるT_reg細胞の蓄積も減少させ、妊娠糖尿病の重要な特徴である脂肪細胞肥大化、組織炎症、巨大仔、グルコース恒常性の世代を超えた長期的な異常などが誘導された。さらに、胸腺上皮Rank欠損マウスへの野生型妊娠マウス由来の内在性T_reg細胞移植により、流産や母体の耐糖能障害、巨大仔がレスキューされた。ヒトの妊娠においても、妊娠糖尿病は胎盤におけるT_reg細胞数の減少と相関していることが明らかにされた。以上の知見から、RANKが妊娠中に女性ホルモンによる胸腺T_reg細胞の発生を促進することが明らかにされ、母体T_reg細胞の機能が妊娠糖尿病の発症と世代を超えた耐糖能異常にも及ぶことを示している。

POINT!

骨転移性前立腺がんは間葉系幹細胞（MSC）のリクルートと骨芽細胞への分化を促進することが知られている。しかしながら、骨髄由来MSCが骨転移性前立腺がん細胞に及ぼす影響については、あまり研究されていなかった。本研究で著者らは、MSC由来のIL-28がIL-28Rα-STAT1シグナル伝達を介して前立腺がん細胞のアポトーシスを誘発することを見出した。その一方で、MSCへの慢性的な曝露は、IL-28誘導性アポトーシスやドセタキセルのような治療薬に抵抗性を示す前立腺がん細胞の選択を促進した。また、MSCに選択されたIL-28抵抗性の前立腺がん細胞は、骨髄中で高い増殖能を示した。アポトーシスに対して獲得した抵抗性は、骨転移性前立腺がん細胞内因性で、IL-28Rαシグナル伝達下流で活性化される転写因子がSTAT1からSTAT3へシフトとすることと関連する可能性が示された。さらに、STAT3の欠失またはSTAT3阻害剤S3I-201の投与はMSCへの慢性的曝露によって選択された前立腺がん細胞の増殖および生存能を失わせることが明らかにされた。以上から、骨髄MSCにより誘導される治療抵抗性の骨転移性前立腺がんの出現はSTAT3を標的とすることで無効化することが可能であることが示唆された。

POINT!

間葉系幹細胞（MSC）は免疫系と密接に相互作用し、ストレス刺激に反応して炎症性サイトカインを分泌することが知られているが、MSC由来の炎症性サイトカインの生物学的機能については未だ解明されていなかった。本研究で著者らは、生理的条件下でもMSCが低レベルのTNFαを産生・放出しており、このTNFαはオートクライン・パラクラインシグナル伝達を介してMSCの自己複製や骨芽細胞への分化を維持するために必要であることを明らかにした。著者らは、生理的レベルのTNFαがTNF受容体非依存的にメカニカルストレスによるエンドサイトーシスを介してMSCの恒常性を維持し、エンドサイトーシスされたTNFαがmTORC2に結合してmTORシグナル伝達を抑制することを発見した。ラパマイシンによるmTORシグナル伝達の阻害は、TNFα欠損や後肢免荷による骨量低下を抑制する骨同化作用を示すことが明らかにされた。以上の結果から、MSCと骨の恒常性を司るTNFαによるmTORシグナルの生理的機序が明らかにされた。

POINT!

造血幹細胞の維持や再生医療の観点から、近年骨髄間質細胞の重要性が注目されている。しかし、骨髄間質細胞の起源については特にヒトについては不明な点が多い。著者らは新生児骨髄や化学療法からの回復時 (hREC) にのみ存在し、健常成人の骨髄には存在しないLNGFR⁺細胞に着目した。LNGFR⁺細胞はCD34などの血管内皮細胞マーカーを発現していた。組織学的解析により、CD31⁺CD105⁺LNGFR⁺細胞は海面骨梁付近の洞様毛細血管に多く見出された。内皮細胞と間質細胞のマーカーを共発現することからこの細胞は内皮-間葉転換(EndoMT)を行っている可能性が想定された。網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、LNGFR⁺ hRECでは対照群の骨髄間質細胞と比較してCDH5 (VE-Cadherin)などの血管内皮マーカーの発現が認められ、LNGFR^– hRECと比較して、骨芽細胞マーカー高い発現が認められた。また、LNGFR⁺ hRECでは上皮-間葉転換(EMT)やEndoMTに関わる遺伝子群も高い発現を認めた。さらなる解析により、これらの細胞はコロニー形成能や造血幹細胞の維持能、軟骨細胞や骨芽細胞への分化能など、間葉系幹細胞の性質も見出された。著者らは過去にIL-33がEndoMTが活発に起こる発生および修復過程において骨髄血管内皮細胞に発現することを見出しており、IL-33によるLNGFR⁺細胞のEndoMT誘導の可能性を着想した。IL-33の添加により血管内皮マーカー発現は低下し、骨芽細胞分化の亢進が認められた。以上より、血管内皮由来のIL-33はEndoMTを誘導し、骨髄環境の構築・再構築に関わることが示された。

POINT!

毛包は生体において再生力の高い組織である。また、成長期と休止期（毛周期）を繰り返すことも毛包の特徴として知られている。毛包には様々な性質を有する細胞が含まれるが、これらの細胞が毛包再生や毛周期を制御するメカニズムには不明な点が多く、毛髪再生療法開発における壁の一つであった。著者らは生涯にわたる毛包再生を可能にする毛包幹細胞ポピュレーションの探索を行った。まず、毛包より単離した細胞を増殖させたり、毛隆起の上部や下部の細胞に分化させるために220を超える培養条件を試みた。その結果、Noggin、FGF-7、FGF-10、Shhアゴニスト、EGF（NFFSE）をアテロコラーゲンゲルに含浸させた三次元培養系において、幹細胞マーカーCD34とCD49fを共発現する細胞の増殖を誘導することを見出した。この培地からEGFを除去したNFFS培地やWntリガンド、Notchリガンド、TGF-β阻害剤を添加したNFFSWN培地では増殖能が低下し、毛隆起の上部や下部のマーカーの発現を誘導した。これらの培地で誘導された細胞がもう周期や毛包再生に寄与するかを検討した。培養毛包上皮細胞と培養毛乳頭細胞を上記の培地で培養して得られた毛包の元基をヌードマウスの背部皮膚に移植したところ、NFFSE培地を用いた場合において、発毛が確認された上に、高い割合で三回以上の毛周期が認められ、NFFSE誘導性の毛包幹細胞の毛包再生への寄与が示唆された。そこで、これらの細胞の表面マーカーをさらに解析し、CD34⁺CD49f⁺Itgβ5⁺細胞に富むことを見出した。フローサイトメトリー法によりCD34⁺CD49f⁺細胞集団からItgβ5⁺のポピュレーションを除去したところ、毛包再生の回数が減少したことから、Itgβ5の重要性が示された。Itgβ5⁺細胞は毛隆起上部のテネイシン発現部位に一致しており、この部分が発毛ニッチである可能性が示唆された。

POINT!

近年、骨髄における造血幹細胞(HSC)ニッチ研究が大きく進展した。それにより、HSCニッチとしての神経系の重要性が広く認められるようになったが、感覚神経のニッチ機能はよくわかっていない。著者らは痛覚神経のニッチ機能を明らかにするために、レシニフェラトキシン(RTX)をマウスに全身投与し、痛覚神経の除神経を行った。このマウスにG-CSFを投与することで末梢へのHSC遊走を促したところ、コントロールマウスと比較してHSCの動員が抑制された。この際、骨髄中のHSC数には有意な差は認められなかった。G-CSF処理で動員された末梢血細胞を用いたreconstitution assayの結果、RTXにより痛覚神経を除去したマウス由来の血球細胞の割合はコントロールと比べて低値であった。感覚神経由来ペプチドのCGRPを投与したところ、除神経マウスの場合でもG-CSF誘導性の末梢HSCが増加した。CGRP受容体構成要素の一つRAMP1を欠損するRamp1^–/–マウスでは、骨髄内のHSC数に変化がない一方、G-CSF誘導性の末梢HSCが減少した。以上より、感覚神経がCGRP–RAMP1を介してHSCの末梢への動員を誘導すると考えられた。CGRPの標的細胞を明らかにするために、Ramp1^–/–マウスとコントロールマウスに放射線を照射し、骨髄キメラマウスを作製・解析した。移入したHSCが野生型の場合はG-CSFによるHSCの末梢への動員が見られた一方、Ramp1^–/–HSCを移入した場合は末梢への動員が抑制されたことから、CGRPはHSCに作用して末梢への動員を促進することがわかった。CGRPシグナルをさらに詳細に解析するために、Ramp1^–/–HSCの遺伝子発現を網羅的に解析し、その結果、Gαs–アデニリルサイクラーゼ–cAMP経路の遺伝子発現の低下を見出した。Ramp1^–/–HSCをホルスコリン(FSK)処理しアデニリルサイクラーゼを活性化したところ、G-CSFによるHSCの末梢への動員が回復した。痛覚神経の刺激がHSCを末梢に動員したことから、食餌によるHSC動員が可能であるかを検討した。カプサイシン含有飼料で飼育したマウスでは、G-CSFによるHSC末梢動員が増加し、この効果はRTX投与により消失した。以上により、痛覚刺激は痛覚神経と神経ペプチドCGRPを介してHSCを抹消に動員することが示された。痛み刺激によるHSC末梢動員は、組織損傷を起こしうる刺激に対して、損傷の規模を抑えたり再生を早めるという生理的意義があると考えられる。

POINT!

骨髄は造血幹細胞を維持し、単球や顆粒球などの骨髄系細胞やリンパ球など、様々な造血系細胞の発生・分化の場として機能する。しかしながら、骨髄内の解剖学的特性が、造血系細胞の分化及び系統決定に与える影響に関しては未だ不明な点が多い。本論文において著者らは、マウス胸骨を用いたホールマウント免疫染色のプロトコルを確立することで、骨髄系細胞（顆粒球、単球、樹状細胞）の増殖分化を組織学的に解析し、顆粒球系と単球・樹状細胞系の前駆細胞はそれぞれ解剖学的に異なる部位で増殖分化することを見出した。単球・樹状細胞前駆細胞の増殖分化はM-CSFを発現する血管の周囲に局在して観察されたが、この構造は血管内皮細胞特異的にM-CSFを欠損したマウスでは認められなかった。リステリア菌の感染に伴う急性ストレスに伴い、顆粒球系および単球・樹状細胞系前駆細胞は骨髄内における解剖学的な局在を保ったまま増殖した。また、血管内皮細胞が産生するM-CSFは、感染に伴う単球・樹状細胞系前駆細胞の増殖にも必要であることが示された。以上より、生理的及び病的環境下において、骨髄造血は解剖学的局在の異なる血管により空間的な制御を受けている可能性が示唆された。

POINT!

頭蓋は脳の成長に連動して拡大する必要があり、頭蓋骨縫合とそこに含まれる間葉系幹細胞が頭蓋骨の拡大に重要な役割を担う。頭蓋骨縫合の早期癒合は、Saethre-Chotzen症候群を含むいくつかの先天性疾患に随伴することが知られており、頭蓋の形態異常、頭蓋内圧の上昇に伴う脳の発達障害と精神発達遅延の原因となる。しかしながら、頭蓋骨縫合早期癒合の動物モデルはこれまで存在せず、有効な治療法の開発を妨げる要因の一つとなっていた。本論文において著者らは、ヘリックス-ループ-ヘリックス型の転写因子であるTwist1遺伝子のヘテロ欠損マウスが頭蓋骨縫合早期癒合に伴う頭蓋内圧上昇と認知障害を呈し、Saethre-Chotzen症候群のモデルとなることを見出した。このマウスの頭蓋骨縫合部を外科的に切離し、切離部にGli1陽性間葉系幹細胞を含む生体分解性キャリアを移植すると、頭蓋骨縫合が再構築され、頭蓋骨変形や認知機能の改善が認められることが明らかとなった。以上より、間葉系幹細胞の移植療法が、頭蓋骨縫合早期癒合の新たな治療戦略として有用である可能性が示唆された。

POINT!

異所性骨化は、筋肉などの軟組織に形成し、組織損傷に伴う炎症によって引き起こされることが知られている。現在異所性骨化に対する有効な治療法はまだ確立されていない。TGF (transforming growth factor)-bスーパーファミリーに属するactivin Aは、活性化したマクロファージなどの炎症細胞から産出され、SMAD2/3を介したシグナルを伝達する。また、異所性骨化の発症は炎症から始まることと、SMAD2/3シグナルは軟骨形成に関与することから、筆者らはActivin Aの異所性骨化への作用を調べた。マウスにBMP (bone morphogenic protein) 2を含むマトリゲルを筋肉に移植すると、異所性骨化が見られたが、Activin Aの中和抗体 (10 mg/kg)を週2回投与することによって異所性骨化が顕著に抑制された。また、病変部のシングルセルRNA-seqを行った結果、Activin A中和抗体を投与したマウスでは、Sox9⁺骨化前駆細胞の集積が減少し、その多くはActivin Aの発現が認められた。In vitroではActivin Aは軟骨細胞分化を促進することが示された。以上から、Activin Aは異所性骨化進行の上流刺激因子として働き、有効な治療ターゲットになりうることが示唆された。

POINT!

頭蓋神経堤細胞は発生時に頭蓋顔面部の骨や軟骨に分化する多分化能幹細胞の一種である。BMPシグナルとオートファジーは、それぞれ幹細胞の恒常性に関与していることが知られていた。ヒトではBMPの受容体であるACVR1の恒常的活性化を引き起こす変異は進行性骨化性線維異形成症（FOP）を引き起こすことが知られている。FOPは体幹結合組織の異所性軟骨化と異所性骨化を特徴とするが、一部の患者では異所性頭蓋顔面骨化をきたす。筆者らは神経堤細胞に特異的にACVR1を活性化させたマウス（ca-Acvr1mutant mice: P0-Cre ca-Acvr1 flox/+）では頭蓋顔面の欠損および異所性軟骨形成を認めることを示した。さらに胎仔のSOX9の発現解析やフェイトマッピングによって、増強されたBMPシグナルは細胞増殖や遊走へは影響を与えずに、頭蓋神経堤細胞を軟骨細胞形成の方向へ決定づけることを示した。続いてca-Acvr1 mutant mice では軟骨の異常形成と一致してmTORC1シグナルが活性化していることを示した。同様にβ-cateninやWnt-β-cateninシグナルの標的遺伝子も発現が上昇していることを示した。最後にca-Acvr1 mutant miceではオートファジーが抑制されていること、またオートファジーの標的はβ-cateninであることを示した。以上の結果から、BMPシグナルとオートファジーが協調的にβ-catenin活性を調節して発生時における頭蓋神経堤細胞の軟骨細胞への分化を調整することを証明した。このことはFOP患者の異所性顔面軟骨形成の予防にオートファジー促進剤やWnt阻害剤が有望な治療法になる可能性を示すものである。

POINT!

線維化は、炎症に対する一般的な病理学的反応である。しかし、中枢神経での神経炎症に対する線維化に関してはその程度や疾患との関わりなど不明な点が多い。本論文で、著者らは多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を用いて、系統追跡実験とシングルセル解析を行い、神経炎症に応答して中枢神経に線維性瘢痕が形成され、その大部分は周皮細胞や骨髄由来細胞でなく、増殖した中枢神経線維芽細胞に由来することを見出した。ヘルペスチミジンキナーゼを使用して増殖する線維性細胞を除去すると、炎症病変内で髄鞘形成機能を有する希突起膠細胞系細胞が増加し、運動障害が改善した。さらに、中枢神経線維芽細胞ではIFN-γ経路の遺伝子発現が亢進しており、線維芽細胞特異的にIfngr1(インターフェロンガンマ受容体1)を欠損させたところ、EAEの中枢神経線維性瘢痕は減少した。以上により、中枢神経での神経炎症に対する瘢痕形成における中枢神経線維芽細胞の役割の一端が明らかとなり、今後の治療標的となる可能性が示唆された。

POINT!

加齢により発生頻度が増すアテローム性動脈硬化やメタボリックシンドローム、がんやフレイルは慢性炎症が寄与すると考えられている。老化した脳も炎症に対して脆弱であると考えられ、認知機能低下やアルツハイマー病は加齢とともに有病率が上昇する。全身性に循環する炎症性因子は認知機能の低下を促進しうるが、加齢に伴い炎症が開始し持続する根本的なメカニズムはよくわかっていない。筆者たちは老化したマウスにおいて、炎症の主要なモジュレーターである脂質メッセンジャー、プロスタグランジンE2（PGE₂）によるシグナル伝達に応答してミエロイド系細胞の生体エネルギーが抑制されることが認知機能低下に繋がることを示した。ヒト単球由来マクロファージから産生されるPGE₂を35歳以下と65歳以上で比べると、65歳以上で有意に高かった。さらにヒト単球由来マクロファージをPGE₂で刺激すると濃度依存的に解糖能とミトコンドリア酸素消費速度が低下した。そこで、PGE2の受容体であるEP2をミエロイド系細胞特異的にノックアウトしたマウス（CD11bCre;EP2^lox/loxマウス）を解析したところ、老齢であっても代謝系が若いマウスと同程度であり、血清および海馬の炎症性因子もコントロールと比べ低下していることがわかった。また、老齢CD11bCre;EP2^lox/loxマウスの認知機能テストのパフォーマンスは若いマウスと同程度であった。老化したマクロファージやミクログリアでは、PGE2の受容体であるEP2を介したPGE₂シグナリングがグルコースのグリコーゲンへの合成を促進しており、グルコース代謝フラックスとミトコンドリア呼吸を減弱させていた。実際に65歳以上のヒト単球由来マクロファージでグリコーゲン合成酵素をノックダウンすると、解糖系とミトコンドリア呼吸が回復し、炎症性マーカーも減少した。老化した細胞にEP2の阻害剤作用させると解糖系とミトコンドリア呼吸が若い細胞のレベルにまで回復し、in vivoにおいても認知機能を回復することができた。この研究により認知的老化は不可逆的なものではなく、ミエロイド系におけるグルコース代謝を調節することにより逆転させることも可能であることが示された。

POINT!

RANKLは破骨細胞、胸腺髄質上皮細胞、腸管M（microfold）細胞の分化に必須のサイトカインであり、その作用はデコイ受容体であるOPG（osteoprotegerin）によって負に制御されている。OPGは血中を循環している可溶性因子であり、OPGの血中濃度は骨疾患や心疾患、炎症性腸疾患と相関することが報告されている。しかしながら生体内におけるOPGの産生源は未知であり、単一臓器由来のOPGが全身を循環し、骨、胸腺、腸管においてRANKLの機能を制御しているのか、あるいはそれぞれの臓器で局所的に産生されるOPGがRANKL制御に重要なのかは不明であった。本研究で著者らはOPGのfloxマウスを作出し、骨、胸腺、腸管におけるOPGの産生源を探索した。シングルセルRNA-seq解析およびOPGコンディショナル欠損マウスの表現型解析の結果から、骨においては骨芽細胞、胸腺においては胸腺髄質上皮細胞、腸管においてはM細胞がOPGの主要な産生源であることが明らかとなった。興味深いことに、骨芽細胞、胸腺上皮細胞、腸管上皮細胞で特異的にOPGを欠損したマウスでは、それぞれ骨、胸腺、腸管において顕著な表現型を呈する一方、いずれのマウスにおいても血中OPG濃度は正常に保たれており、循環OPGは骨および免疫組織の恒常性に寄与しないことが示された。以上から、血中OPGでなく局所で産生されたOPGこそが骨免疫システム制御に重要であり、RANKLの多彩な機能は局所的に厳密に制御されていることが明らかとなった。

POINT!

Osteoprotegerin（OPG）はRANKLのおとり受容体であり、RANKLシグナルを抑制することで、破骨細胞の分化、成熟、機能を抑制する。RANKLコンディショナルノックアウトマウスを用いた研究によって、骨代謝調節におけるRANKLの産生源は骨芽細胞、軟骨細胞、骨細胞であることが明らかにされていたが、OPGを産生する細胞は明らかではなかった。本研究では、OPGのfloxマウスを作出し、OPG産生細胞の同定および機能解明を試みた。過去の報告では、B細胞、骨細胞、骨芽細胞がOPGの産生源である可能性が示唆されていたが、B細胞および骨細胞特異的なOPG欠損マウスでは骨量に変化が認められず、B細胞と骨細胞はOPGの主要な産生源ではないことが示された。対照的に、骨芽細胞特異的にOPGを欠損したマウスでは、OPGのグローバルノックアウトマウスと同等の骨量減少を示したことから、骨芽細胞がOPGの主要な産生源であることが示された。興味深いことに、骨芽細胞特異的OPG欠損マウスでも血中OPG濃度は正常に保たれており、血中OPGのソースは骨芽細胞ではないこと、そして血中OPGは骨代謝制御に寄与しないことが明らかとなった。以上より、骨芽細胞が局所的に産生するOPGが骨恒常性に必須の役割を持つことが示された。

POINT!

疾病や損傷により失われた組織を再生する能力は、脊椎動物の中で種によって大きく異なる。例えば、硬骨魚類は高い組織再生能力を有しており、付属肢(鰭)、心室、脊髄など多種の器官を再生できるのに対し、哺乳類は一般的に組織再生能力が低いと言われている。しかし、この再生能力の違いを生むメカニズムは不明であった。本研究でWangらは進化的に離れたゼブラフィッシュとメダカを用い、ChIP-seq、RNAs-seq及びシングルセルRNA-seqの結果から、種を越えて保存された再生応答性エンハンサー(RRE)を見つけた。RREは尾鰭の切断によって活性化され、下流のInhba (activin A)の発現を制御する。Inhba-RREの欠損は尾鰭及び心臓の再生を阻害した。Inhba-RREには機能的に重要なAP-1結合モチーフがあり、損傷応答と再生応答を起こす。一方、ヒトもAP-1結合モチーフのあるInhba RREのオルソログを持っている。しかし、ヒトRREをRRE欠損メダカに導入してもメダカの再生能力が回復しないことから、ヒトRREは再生応答を誘発できないことがわかった。以上から、進化の過程でのRREの変化が再生能力に影響していることが明らかとなった。

POINT!

多発性硬化症罹患者では、腸内細菌叢に特徴がある。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症モデルとして広く用いられる疾患モデルであり、神経性炎症の重症度に腸内細菌が関与していることが知られている。しかし、腸内細菌がどのようにして遠隔臓器である神経系の炎症を誘導しているのかは不明であった。筆者らは、独立した2種の腸内細菌が病原性を有するミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）特異的なT細胞の分化を腸内にて誘導することを示した。様々な抗生剤を単剤で投与したマウスにEAEを誘導した結果、EAEの発症はアンピシリン投与によって抑制された。アンピシリン投与マウスの腸内では、Erysipelotrichaceae科の細菌（OTU0002）が減少していた。OTU0002は腸内にてTh17細胞を分化誘導し、EAEの発症に十分であることが示されたが、EAEの重症度は、比較的軽微であり、他の細菌がEAEの発症に関与することが示唆された。筆者らは、shotgun sequence 法により腸内細菌の遺伝情報を解析した結果、MOGと類似したペプチドを持つLactobacillus reuteriを同定した。L. reuteriのUvrAにコードされるペプチドは、交差性にMOG特異的T細胞の活性を誘導した。また、OTU0002とL. reuteriを無菌マウスに移入することでEAEの症状が増悪した。以上より、L. reuteriがMOG特異的なT細胞の活性化を誘導し、OTU0002が病原性を付与することで、EAEの増悪化を引き起こすことが明らかにされた。

POINT!

変形性関節症は、関節軟骨の不可逆な破壊が進行する変性疾患である。変形性関節症の病因は複雑であり、遺伝体質や外傷、慢性炎症などの様々な要因が絡んでいる。筆者らは骨格幹細胞における軟骨再生と年齢との関連、および変形性関節症への寄与について検討した。筆者らは加齢に伴い骨格幹細胞が喪失すること、ヒトおよびマウスの関節で軟骨形成が減少することを示した。これまでMF手術(microfracture surgery)を施すことによる再生誘導刺激により、成人マウスの関節軟骨の表面において、局所の骨格幹細胞を増加させることが示されている。MF手術によって活性化した骨格幹細胞は通常、線維組織を形成する傾向にあったが、MF手術部位をBMP2と可溶性VEGFR1（VEGF受容体阻害因子）を含んだハイドロゲルで処理するにより骨格幹細胞は関節軟骨に分化する傾向にあった。これらの知見は骨格幹細胞はMF手術に続き、変形性関節症の限局した軟骨病変の軟骨再生治療に寄与する可能性を示している。

POINT!

脂肪細胞が骨量を制御することは知られているが、そのメカニズムには不明な点が多い。著者らは、脂肪細胞特異的にDTRを発現するマウス(DTR^ADQマウス)を作製し、成体マウスにおける脂肪細胞の除去が骨に与える影響を検証した。8週齢のDTR^ADQマウスにDTまたはPBSを投与したところ、DT投与群では、皮下白色脂肪組織、精巣上体周囲白色脂肪組織、褐色脂肪組織および骨髄脂肪組織の減少が確認された。DT投与開始から10日後の大腿骨および脊椎の解析において、コントロールと比較して1000%もの骨量の増加がみられた。DT/DTR^ADQマウスは耐糖能異常を示すが、野生型マウス由来白色脂肪組織を移植したところ、耐糖能異常は改善された一方で骨量増加に変化はなかった。DTR^ADQマウスと野生型マウスのparabiosisにおいて、野生型マウスまたはDTR^ADQマウスにDTを投与したところ、DTR^ADQマウスのみで骨量の増加がみられたことから、脂肪細胞除去による骨量増加に寄与しているのは末梢の脂肪組織ではなく、骨髄脂肪組織であることが示された。また、DT/DTR^ADQマウスの骨髄細胞ではChrdl1、Grem1の低下およびWisp1の上昇がみられ、BMPR signalingが亢進していることが明らかになった。DT/ DTR^ADQマウスへのBMPR inhibitorの投与によって、骨量増加は抑制された。さらに、DT/ DTR^ADQマウスにおいてEGFR signalingがBMPR signalingに協調的に働き、EGFR inhibitorの投与により骨量増加が抑制されることも示された。以上により、骨髄脂肪細胞による骨量制御メカニズムが明らかになった。

POINT!

老化組織では実質細胞と共に免疫細胞の機能にも変化がおこり、これらが複合的に組織再生に影響する。関節組織の老化は、外傷後の変形性関節症(PTOA)発症の原因となる。本研究において、著者らは細胞老化とPTOAにおける免疫系の関係に着目した。OAを模倣する前十字靭帯切断(ACLT)モデルマウスの関節組織を解析したところ、受傷後早期にCD8⁺T細胞とγδT細胞の細胞数増加、およびIL-17A産生CD4⁺T細胞とIL-17F産生γδT細胞の割合の増加を認めた。その後、所属リンパ節(鼠径リンパ節)ではI型およびIII型自然リンパ球(ILC)も出現した。損傷関節では、老化細胞の特徴であるCdkn1aとCdkn2aの持続的発現上昇が見られた。老齢マウスの所属リンパ節では若齢マウスよりもIL-17A発現率が高値であった。老化細胞の除去(senolysis)がOAに与える影響を解析するために、senolysis誘導薬のUBX0101とNavitoclaxを投与した。老化細胞を除去したマウスでは、Th17細胞数やIl117aやIl17f発現が減少し、関節組織にも改善が見られた。老化と17型炎症反応の関係をさらに検討するために、IL-17A中和抗体を関節腔投与したところ、Cdkn1aの発現低下を伴う関節症状の寛解が認められた。In vitroの実験では、老化を誘導した線維芽細胞はTGF-β存在下で共培養したナイーブT細胞によるIL-17産生増加を誘導した。一方、Th17細胞は共培養した線維芽細胞のIL-6産生を促進した。損傷関節では組織修復に関わるIL-4が発現したが、この発現は老化細胞の除去やIL-17中和抗体の投与によって促進した。Il4r^–/–マウスにACLTを行ったところ、老化細胞の除去によるOA治療効果は認められなかった。以上より、IL-17は関節組織の細胞老化によるPTOA増悪において中心的な役割を果たすことが明らかになった。

POINT!

気道上皮前駆細胞の中で、II型肺胞上皮細胞(AT2)は様々な病態からの組織再生に重要であることが近年相次いで報告された。AT2は定常状態では肺サーファクタントの分泌細胞として機能することから、著者らは肺障害における上皮の喪失がAT2機能を変化させ、幹細胞に変容させると考えた。酸の吸入により無菌性肺損傷を惹起したマウスよりAT2を単離し、ATAC-seq解析を行ったところ、非損傷組織と損傷組織とではAT2オープンクロマチン領域は大きく異なっており、STAT3、ELK4、TBX5、SPIBの結合モチーフが抽出された。肺胞灌流液中にIL-6が見出されたことから、これらの転写因子のうちSTAT3に着目した。肺損傷モデルマウスやびまん性肺胞障害のヒト患者の肺組織ではSTAT3リン酸化が見出された。AT2特異的にSTAT3を欠損するSftpc^CreERT2Stat3^f/fマウスでは、肺損傷後の組織再生が著しく障害され、肺胞還流液中にはタンパク質の漏出が多く認められた。さらに、このマウスのAT2の増殖活性は低下していた。急性期にはコントロールマウスの肺組織との差異に乏しかったことから、肺損傷時のAT2において、STAT3は亜急性期〜慢性期に重要と考えられた。STAT3の標的遺伝子を明らかにするために単細胞RNA-seq解析を行った。肺損傷により分化転換しているクラスターで高発現し、STAT3結合配列を有する遺伝子として、Bdnfが抽出された。実際、Sftpc^CreERT2Stat3^f/fマウスの肺胞や肺胞還流液ではBDNF発現が低下していた。BDNFはAT2と肺の間葉系細胞の共培養におけるオルガノイド形成を促進したことから、BDNFの肺胞再生促進作用が示唆された。AT2特異的にBDNFを欠損するSftpc^CreERT2Bdnf^f/fマウスでは肺損傷からの回復が障害され、タンパク質の漏出増加やAT2の増殖活性の低下が認められた。BDNF受容体TrkBはAT2ではなく、肺胞ニッチ細胞(MANC)とよばれる間葉系細胞で発現していた。間葉系細胞でTrkBを欠損するPdgfra^CreERT2Ntrk2^f/fマウスでは、肺損傷後の回復が障害された。FGF7はMANC由来の重要なサイトカインとされているが、Sftpc^CreERT2Stat3^f/fマウス、Sftpc^CreERT2Bdnf^f/fマウス、Pdgfra^CreERT2Ntrk2^f/fマウスではFGF7産生レベルは低値であった。FGF7は肺胞オルガノイド形成を促進した。TrkBアゴニストの7,8-DHFを投与したところ、肺胞組織の回復が促進された。以上より、肺胞損傷時にはAT2でSTAT3–BDNF–TrkB経路を介してFGF7産生が促進され、組織再生が誘導されることが明らかになった。

POINT!

感染に伴い自然免疫系が活性化されると疼痛が惹起されるが、自然免疫と感覚神経をつなぐメカニズムには不明な点が多い。著者らは、持続する疼痛を伴う慢性炎症を引き起こす完全フロイントアジュバント(CFA)をマウスの足底部に注射し、神経-免疫クロストークを解析した。CFA注射による接触過敏の誘導に伴い、脊髄背側ではTLR1/2/6の、後肢ではTLR2/6の発現が上昇した。Tlr2^–/–マウスでは、CFA投与による機械的刺激や温熱刺激に対する過敏は見られなかったため、TLR2はCFAによる疼痛反応に関与することが示された。Tlr6に対するsiRNAの足底部投与は疼痛を緩和したため、TLR6もCFA誘導性の疼痛の発現に寄与すると考えられた。TLR2/6ヘテロダイマーのアゴニストであるFSL1の投与は痛覚過敏を惹起し、この時投与部には白血球の浸潤が起きていた。また、後根神経節(DRG)ではグルタミン合成酵素(GS)陽性グリア細胞でTLR2発現が上昇した。TLRシグナル下流ではインフラマソームが活性化されるが、インフラマソームの疼痛への影響には不明な点が多い。FSL1刺激によりNlrp3発現が上昇したことから、TLR誘導性疼痛へのインフラマソームの関与が示唆された。Nlrp3^–/–マウスやNLRP3阻害剤MCC950を投与したマウスでは、FSL1誘導性の疼痛が大きく緩和された。NLRP3がTLR2による疼痛反応を仲介するメカニズムを明らかにするために、DRG中のサイトカインとケモカインを解析したところ、FSL1投与でIL-33が上昇したが、その上昇効果はNlrp3^–/–マウスやTlr2^–/–マウスでは限定的であった。このとき、IL-33はDRGでは神経細胞近傍に存在するサテライトグリア細胞によって、後肢ではケラチノサイトによって産生された。IL-33受容体のST2は神経細胞で発現しており、ST2中和抗体の投与は機械的刺激や熱刺激による疼痛を軽減した。以上より、末梢組織で発生したTLRシグナルはインフラマソームを介して末梢組織と神経節でIL-33を誘導し、痛覚を生じることが示された。

POINT!

多くのB細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）患者は骨減少症や骨壊死など、治療に関連した長期的な健康問題を経験することが多い。ALLと診断された時点で骨折を発症している患者もいることから、著者らは白血病B細胞が骨の病理に直接寄与している可能性を検討した。B-ALLに起因する骨破壊メカニズムを明らかにするため、自然発症B-ALLモデルのp53^–/–; Rag2^–/–; Prkdc^scid/scid三重変異（TM）マウスとp53^–/–; Prkdc^scid/scid二重変異（DM）マウスが使用された。TM白血病細胞はRANKLを強く発現しており、TM白血病細胞を含む脾臓細胞を放射線照射したRag2^–/–マウスに移植すると、顕著な海綿骨量減少が生じた一方、DM細胞細胞の移植では骨量の変化は誘導されなかった。ヒトB-ALL診断時に回収したヒトB-ALL細胞でもRANKLが発現していたことから、これらの細胞をNOD. Prkdc^scid/scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）マウスへ移植して骨への影響を観察したところ、特に骨幹端においてRANKL発現細胞が多く観察され、多核破骨細胞の増加や骨破壊の誘導により海綿骨減少がもたらされた。これらのマウスにリコンビナントOPG-Fcを投与したところ、骨破壊が抑制された。著者らのデータは、B-ALLによって誘導される骨破壊の原因となるRANK-RANKLシグナルの重要性を示しており、これらの患者に対するRANKLを標的とした治療の有効性が示唆された。

POINT!

変形性関節症（OA）の進行を制御するプロセスについて十分に解明されてはいないのが現状である。本研究で著者らは、OAと免疫グロブリン様コラーゲン認識受容体であるosteoclast-associated receptor（OSCAR）発現上昇との関連を明らかにした。OSCAR欠失マウスで半月板不安定化によりOAを誘導すると、野生型と比較して関節軟骨の破壊、軟骨下骨の骨硬化、硝子軟骨の喪失などのOAの症状が抑制されていた。RNA-seqなどの解析から、これらの現象は関節軟骨におけるTRAIL発現の低下及びOPG発現の上昇に起因していることが明らかにされた。また、マウス関節軟骨の初代培養細胞において、IL-1bとコラゲナーゼ刺激によりOSCAR発現が上昇し、アポトーシスが促進されることも示された。さらに、OAモデルマウスに対するヒトOSCAR-Fc融合タンパク質の投与により関節軟骨細胞のアポトーシスが抑制され、OA症状が改善された。以上から、OSCAR阻害がOA治療の標的となる可能性が示唆された。

POINT!

Cre-loxPシステムは、マウスにおける遺伝子ノックアウト、ノックイン、リポーター発現の空間的・時間的制御に非常に有用である。しかしながら、神経系特異的遺伝子組換えのために設計された様々なCre発現マウスにおいて、異なる頻度で生殖細胞系列における遺伝子組換えが起こることが報告されている。著者らは、神経系で一般的に使用されている64のCre発現マウスの母方・父方の生殖細胞系列における遺伝子組換えデータを集約し、それらの半数以上（64.1%）で生殖細胞系列における組換えが起こることを示した。同じプロモーターによるCre発現マウスの異なる系統間でも、その設計により生殖細胞系列における組換え効率に違いがあった。また、標的遺伝子座ごとに組換え効率が異なり、レポーターマウスによる確認のみでは対象とする遺伝子座の組換えが起こっているかどうかの確認には不十分であることも明らかにされた。同様の現象は、他のFlp-frtやDre-roxなどの組換えシステムや遺伝子組換え生物にも適用されうると考えられる。著者らは、本論文でCre-loxPシステムの生殖細胞系列における組換えに注意を喚起し、Cre-loxPシステムを用いたマウス実験のガイドラインを提示する。

POINT!

炎症性腸疾患と歯周炎には疫学的な相関が認められるが、そのメカニズムの詳細は不明であった。本論文で著者らは、マウスの歯の周囲に絹糸を結紮することで常在菌依存的な歯周炎を誘導すると、DSS（デキストラン硫酸ナトリウム）誘導性腸炎モデルが増悪することを見出した。歯周炎を誘導したマウスでは、歯周炎組織だけでなく腸管粘膜でもTh17細胞の数及び頻度が増加しており、これらは口腔細菌に対する抗原特異性を有していた。光変換蛍光タンパク質を発現するカエデマウスを用いた解析により、歯周炎組織で誘導されたTh17細胞が腸管粘膜へと遊走し、唾液と共に飲み込まれた口腔細菌を腸管で認識することで再活性化し、腸炎の増悪に寄与することが明らかとなった。以上より、口腔疾患と他臓器疾患の連関を説明するメカニズムとして、「口腔細菌とそれを認識する免疫細胞とが双方とも移動し、他臓器で再び遭遇することで炎症を引き起こす」という新たな可能性が提唱された。

POINT!

乳がんにおいて骨転移は主要な死因の一つであるが、その病態メカニズムは未だ不明な点が多い。著者らは、乳がん患者の骨転移検体およびマウスモデルにおいて、骨転移巣へのマクロファージの浸潤を明らかにした。続いて、乳がん細胞左心室内移入により骨転移が形成されたマウスに、clodronate liposomeを投与してマクロファージを枯渇させたところ、マクロファージ枯渇群で骨転移の進展が有意に抑制された。また、Lineage trackingにより、Ly6C⁺ CCR2⁺炎症性単球が骨転移巣のマクロファージの起源であることがわかった。骨転移巣および正常な骨組織のマクロファージをRNA-seqおよびフローサイトメトリーで解析したところ、骨転移巣のマクロファージではCD204およびIL-4Rが高発現していた。さらに、Il4ra^–/–マウス由来の単球を移植したマウスでは、骨転移の進展が抑制された。以上の結果から、IL-4R依存的に骨転移を促進する単球由来マクロファージの存在が明らかになった。この研究により、IL-4Rおよびマクロファージの阻害が乳がん骨転移の新規治療標的となる可能性が示唆された。

POINT!

ヒトにおいては、機械感受性イオンチャネルをコードしているPIEZO2遺伝子の変異により脊柱側弯症や股関節形成不全を含む骨格異常を呈することが知られている。筆者たちはマウスにおいて、固有感覚システム中のPiezo2欠失がヒトの骨格異常を再現することを見出した。四肢骨格形成に重要な間葉系細胞に発現するPrx-Cre、I型コラーゲンのCreマウス（Col1a1-Cre）やII型コラーゲンのCreマウス（Col2-Cre）でPiezo2を欠失してもヒトで見られるような骨格異常は引き起こされないにもかかわらず、神経系のGABA駆動性介在ニューロンに発現するパルブアルブミンのCreマウス（Pvalb-Cre）でPiezo2を欠失すると脊椎の配列異常や股関節形成不全を生じることがわかった。固有感覚系回路網を欠失するRunx3あるいはEgr3の変異マウスの表現型も確認したところ、股関節形成不全が見られた。Wnt1-Creで末梢神経系におけるRunx3を欠失してもEgr3欠損マウスと同様の関節異常を引き起こすことがわかった。しかし、骨格系（Col1a1-Cre、Col2-Cre）でRunx3を欠失しても股関節形成の異常は認められなかった。以上のことから、固有感覚システムが骨格への制御的役割を持つという新たな知見が得られた。

POINT!

炎症性腸疾患と中枢神経疾患は臨床的、実験的な知見から関連があることが見出されてきたが、神経系が腸管免疫を制御する機構は十分に理解されていない。本研究にて筆者らは、肝臓―脳―腸連関を介した迷走神経反射によって腸管制御性T細胞(Treg)の分化と維持を制御していること示している。腸管固有粘膜層に存在する抗原提示細胞は神経伝達物質受容体を発現し、pTregの分化誘導を制御していることが示された。腸管と脳を結ぶ神経回路を探索した結果、肝臓と脳を結ぶ神経回路がTregの制御に関与し、当該神経回路の切断によって、誘導性腸炎が増悪することが示された。さらに、抗生物質やMyd88欠損マウスを用いた解析から、腸内細菌がこれら一連の経路のトリガーであることが明らかにされた。よって、腸内の情報が肝臓にて統合され、神経系を介し遠隔臓器へ情報が伝達されるという情報伝達機構の存在が証明された。

POINT!

加齢に伴う骨格筋量の減少（サルコペニア）と骨粗鬆症はしばしば合併することが知られている。骨粗鬆症に対する治療薬は複数あるが、これまでのところサルペニアに有効な治療法は開発されていない。筆者らは骨粗鬆症の治療薬である抗RANKL抗体デノスマブの投与によって転倒頻度も低下することや、RANKLと拮抗するOPGの投与によって筋萎縮マウスモデルの筋力が回復することが報告されていることに注目した。筆者らはまず閉経後骨粗鬆症患者ではデノスマブの投与によって体肢除脂肪量と握力が上昇することを示した。次に筆者らはRANKL過剰発現マウスではミオスタチンなどの抗筋原性遺伝子および炎症性遺伝子の発現上昇を認め、筋量・筋力・筋細胞のグルコース取り込みが低下することを示した。またマウス横紋筋細胞株を用いてRANKLがNF-kBシグナルを介してインスリン抵抗性を促進することを示した。一方でOPGやデノスマブの投与によってRANKL過剰発現マウスの筋量・筋力・グルコース取り込みが回復することを示した。さらに筆者らは骨量低下・筋量低下・インスリン抵抗性を示すことが報告されているPparb欠損マウスを用いて、OPGの投与が骨格筋のインスリンシグナル伝達と炎症性遺伝子の発現を正常化させて筋量・筋力を回復することを示した。以上よりRANKLの阻害は骨粗鬆症マウス・患者の筋力やインスリン感受性を改善することが判明した。従ってデノスマブはサルコペニアの新たな治療アプローチになりうることが示された。

POINT!

骨組織は、骨代謝の活発な海綿骨と不活発な皮質骨からなっているが、骨代謝率を決定するメカニズムは明らかになっていない。骨細胞はWnt/b-カテニンのアンタゴニストとして働くSclerostinを分泌し、骨形成を阻害できる。破骨細胞から分泌される白血病抑制因子(LIF)はSclerostinの発現を抑制することが報告されている。筆者らは、Sostレポーターマウスと培養破骨細胞を用いて、骨組織におけるSclerostinの発現と骨代謝との関係を検討した。マウスの骨組織では、Sclerostin陽性骨細胞は皮質骨に著明に多く、海面骨内に存在する破骨細胞の近傍の骨細胞にはSclerostinが発現していなかった。抗RANKL抗体を投与すると海綿骨の骨代謝が低下し、LIF陽性TRAP陽性破骨細胞が減少し、Sclerostin陽性骨細胞は増加した。RANKL^+/−マウスでは、破骨細胞の減少は軽度であったが、LIF陽性破骨細胞が減少し、Sclerostin陽性骨細胞が増加しており、海綿骨の骨代謝は低下していた。また、培養破骨細胞ではRANKL濃度依存的にLif mRNA発現量が上昇した。本研究によって、海綿骨においてLIF陽性破骨細胞が骨細胞からのSclerostin発現を抑制し、骨代謝を制御しうることが示された。

POINT!

歯槽骨や歯根膜などの歯周組織ではターンオーバーが起きているが、歯周組織幹細胞の実態はよく分かっていなかった。Gli1⁺細胞はマウスの切歯、頭蓋顔面の骨、長管骨の幹細胞であることが知られている。Gli1–LacZマウスの解析により成獣マウスにおいてGli1⁺細胞がP21以降、徐々に根尖孔付近の歯髄さらには、根尖部の歯根膜腔に現局していくことが明らかになった。タモキシフェン処理した直後のGli1–Cre^ERT2Ai14マウスにおいて、Gli1⁺細胞は線維芽細胞、骨芽細胞、血管、神経とは異なる細胞であったが、血管や神経の近傍に存在することが示された。さらに、月単位での時間経過により、Gli1⁺細胞は歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯槽骨骨細胞、歯髄細胞に分化することが明らかになった。EdUアッセイを行ったところ、Gli1⁺細胞はEdU陽性率が低値を示した。歯根分岐部を28G針で穿刺することにより歯周組織を損傷させ、組織再生を誘導したところ、EdU⁺Gli1⁺細胞は増加し、再生部位の骨形成に寄与した。タモキシフェン処理したGli1-Cre^ERT2Ai14Axin2-LacZマウスの解析によりGli1⁺細胞の一部はAxin2を発現することが見出されたため、歯周組織幹細胞におけるWntシグナルの解析に着手した。タモキシフェン処理したGli1-Cre^ERT2Ctnnb1^f/fAi14マウスにおいては、著明な歯槽骨の欠損が認められ、これらの細胞におけるWntシグナルの重要性が示された。対合歯の抜去により咬合力負荷を減少させたところ、根尖部歯周組織ではGli1⁺細胞が減少していた。タモキシフェン処理したGli1-Cre^ERT2Ai14Sost^–/–マウスではこの効果がキャンセルされた。以上より、咬合力によるメカニカルストレスは歯槽骨のスクレロスチンを介してWntシグナルを調節し、Gli1⁺歯周組織幹細胞の活性を調節することが明らかになった。

POINT!

伸展による皮膚の増殖は欠損の再建手術に利用されている現象であるが、そのメカニズムはようやく解明され始めた段階である。著者らは、マウスの背部に術後1日で4 mLに増大するハイドロゲルを埋入した。ハイドロゲルの膨張に伴い一過性に埋入部の上皮細胞の密度が低下したものの、速やかに細胞増殖がおこり、術後4日の時点で密度は回復した。このとき、細胞間接着分子の発現に変化はなかったものの、免疫染色法にてα-カテニンの張力感受性ドメインa18の蛍光輝度が増加したため、接着分子のリモデリングが起きていると予想された。Krt14–CreERRosa^Confettiマウスを用いた上皮細胞のクローン増殖の解析から、基底細胞は自己増幅する幹細胞ポピュレーションと上層の細胞に分化するポピュレーションが存在するという、ニッチモデルの挙動をとることが示唆された。実際、皮膚伸展に伴いKrt14⁺Krt10^–幹細胞は増加した。進展誘導性の基底細胞増殖のメカニズムを明らかにするために遺伝子発現の網羅的解析を行った。その結果、接着分子、small GTPase、細胞骨格の遺伝子発現が上昇し、EGFRシグナル、MAPK経路、YAP経路の活性化も見出された。また、ATAC-SeqによりAP1ファミリー転写因子の活性化が見出された。さらに、pseudotime解析により、ストレス応答が惹起されることも明らかになった。上記の結果から、各種遺伝子改変マウスと阻害剤投与を行い、細胞骨格およびそのリモデリングに関わる分子、MAPK経路、YAP経路が伸展による上皮増殖に影響するかを解析した。その結果、Diaph3、Myh9、MEK–ERK–AP1経路、Yap1、MALの関与が示された。以上より、皮膚伸展によって上皮細胞では細胞接着分子や細胞骨格のリモデリングが起き、MAPK経路やYAP経路が駆動され細胞の増殖が起こることが明らかになった。

POINT!

海馬におけるシナプスリモデリングは、経験したことを神経回路として記憶するために必須の機構である。ミクログリアは活性化に伴いシナプスを貪食したり、逆にシナプス形成を促進することで、記憶の制御に寄与する。しかし、ミクログリアの活性化メカニズムについて知られていることは少ない。著者らは近年、アストロサイト由来のIL-33が脊髄と視床におけるシナプス数調節に関わることを見出した(Science, 2018)。本研究において、著者らはIl33^mCherry/+マウスの解析から、海馬ではNeuN⁺神経細胞が主たるIL-33産生細胞であることを見出した。海馬の歯状回領域では70%以上の神経細胞がIL-33⁺であり、特に顆粒細胞に認められた。IL-33発現が経験によって変動するかを検討するために、Il33^mCherry/+マウスをenriched environment (EE: ラット用の大きなケージでホイールや玩具などが設置された環境) で飼育した。その結果、EE飼育マウスの海馬では有意なIL-33発現上昇を認めた。一方、隔離飼育した場合は歯状回のIL-33⁺細胞数が減少した。IL-33は神経新生の2~4週後に発現することがわかった。各々の細胞のIL-33発現強度には差が認められた。この強弱が神経機能に関わるかをscRNA-Seq法にて検討した。歯状回ニューロンは#0と#2の二つのクラスターに分かれたが、IL-33⁺細胞はクラスター#2と一致した。このクラスターでは細胞接着、シナプス形成・可塑性、カドヘリン、細胞外基質の合成・リモデリングに関わる遺伝子が高発現していた。また、IL-33の発現レベルはスパインの数とcFos(神経活動性の指標)の陽性率と相関していた。IL-33の標的細胞を探索したところ、ミクログリアがIL-33受容体のIL-1RL1を高発現することを見出した。ニューロン特異的にIL-33を欠損させたIl33^f/fSyn1^CreマウスとミクログリアでIL-1RL1を欠損するIl1rl1^f/fCx3cr1^CreER/+マウスの歯状回とCA1領域ではスパインが減少した。この時、ミクログリアの数には変化はなかったが形態が変化していた。Il33^f/fSyn1^Creマウスでは、歯状回顆粒細胞の活動性シナプス後電位の頻度の低下を認めた。Il1rl1^f/fCx3cr1^CreER/+マウスではEEモデルによるシナプス増加効果が消失した。これらのマウスでは、恐怖記憶の定着が障害された。Il33^f/fSyn1^Creマウスでは、ミクログリアによる細胞外基質分子アグリカンの貪食が減少し、アグリカンが海馬に多量に沈着していた。以上より、経験記憶のプロセスにおいて、ニューロン由来のIL-33はミクログリアによるシナプスリモデリングを活性化させることで記憶形成を促進することがわかった。

POINT!

腸クロム親和性細胞は、セロトニン（5-HT）産生を介して消化管の運動や水・電解質輸送を調節している。近年、腸内細菌やその代謝産物がセロトニン産生を制御することが示されたが、その分子メカニズムは未解明であった。本研究で著者らは、機械刺激受容体として知られるPiezo1チャネルが腸管では一本鎖RNA（ssRNA）のセンサーとして機能し、それにより5-HT産生を制御していることを明らかにした。マウス腸管上皮特異的にPiezo1を欠損させると、腸蠕動運動が著しく減少し、DSS誘導性腸炎が抑制され血清中の5-HT量が減少した。さらに、5-HTの減少は骨形成や海綿骨量を上昇させた。特筆すべきことに、腸管上皮のPiezo1は機械的刺激では活性化されず、抗生物質により腸内細菌を減少させると腸管上皮のセロトニン産生が抑制されたことから、糞便中に含まれる様々な腸内細菌由来分子のスクリーニングを行った結果、糞便中のssRNAが天然のPiezo1リガンドとして同定された。ssRNA刺激による腸管5-HT合成は MyD88/TRIF非依存的に誘発され、RNase Aを大腸に4週間連日注入すると腸の運動性が改善され、さらに骨量が増加した。これらの結果から、腸内細菌由来のssRNAが全身の5-HT量を決定する因子で、ssRNA-Peizo1が腸で産生されるセロトニンの関連する様々な疾患の理解や治療標的となる可能性があることが示唆された。

POINT!

骨壊死や骨折などで骨細胞死の上昇が観察されるが、それらが破骨細胞による骨吸収を活性化するメカニズムは不明であった。本研究で著者らは、破骨細胞がネクローシスした骨細胞に曝露されるとマクロファージ誘導性C型レクチン（Mincle）発現を強力に活性化させ、それによりネクローシスした骨細胞から放出されるダメージ関連分子パターン（DAMP）を感知して破骨細胞分化が誘導され、骨量減少の引き金となることを明らかにした。RNA-seq解析と代謝解析により、Mincle活性化はカルシウムシグナルを介して破骨細胞分化を活性化し、さらに細胞内代謝を酸化的リン酸化へシフトさせていることが明らかにされた。Mincle欠損マウスでは骨細胞死誘導後の破骨細胞活性化や海綿骨量減少が抑制され、骨折修復の改善、血清移入関節炎モデルにおける炎症性骨量減少の抑制が観察された。さらに、ヒト大腿骨頭壊死や顎骨壊死でもMincleが高発現し、破骨細胞活性に関連する遺伝子発現との相関がみられた。以上より、骨細胞死に伴う破骨細胞の活性化にDAMP-Mincleを介したシグナルが関わることが示された。

POINT!

胚中心反応は濾胞性制御性T（T_FR）細胞の生成を増強する。しかしながら、T_FR細胞形成を促進する分子メカニズムは不明であった。本研究で著者らは、濾胞性ヘルパーT（T_FH）細胞のサブポピュレーションとT/B細胞境界領域に多く局在する線維芽細胞様細網細胞から分泌されるスクレロスチンドメイン含有タンパク質1（SOSTDC1）が、T_FR細胞の発生に必要であることを明らかにした。SOSTDC1はWNT/b-カテニンシグナルを阻害することで、T_FR細胞の分化を促進する。レポーターマウスを用いた運命追跡法やトランスクリプトーム解析によって、SOSTDC1を発現するT_FH細胞はSOSTDC1陰性T_FH細胞の後に発生し、B細胞の抗体産生を刺激する能力を失った別のT細胞集団であることが明らかになった。特筆すべきことに、T_FH細胞におけるSOSTDC1の欠失はT_FR細胞を著しく減少させ、結果的に胚中心反応を上昇させた。これらの知見は自己免疫疾患に対する治療、ワクチン開発などに重要な影響を持つと考えられる。

POINT!

　運動の繰り返しは骨格筋のミトコンドリアによるエネルギー産生を向上させる。著者らは運動に伴い骨格筋でIL-13の発現が上昇することを見出し、この分子の機能を解析した。4週間の持久力トレーニングにより、マウス骨格筋ではILC2とIL-13産生ILC2の割合が増加した。Il13^–/–マウスの解析を行ったところ、持久力の低下を認めた。これらのマウスと野生型マウスの腓腹筋の網羅的トランスクリプトーム解析をもとにジーンオントロジー解析を行った。野生型マウスと比較しIl13^–/–マウスの筋では、ミトコンドリア機能に関わる遺伝子群の発現が低かった。Il13^–/–マウスの酸素取り込みは低下しており、培養筋芽細胞へのrIL-13の添加はミトコンドリアの増加と酸素取り込みの増大を誘導した。一般的に、持久力トレーニングではoxidativeタイプの筋線維が増えglycolyticタイプは減少するが、Il13^–/–マウスの筋ではこの変化が見られなかった。ACTA1-Creにより骨格筋特異的にIl13raやStat3を欠損させたマウスでも運動機能の低下と脂肪酸酸化の低下が見られた。以上より、持久力トレーニングは骨格筋におけるIL-13発現を誘導し、IL-13はStat3を介して骨格筋細胞の代謝機能を調節し、運動機能を向上させることが示された。

POINT!

MRSAが産生するα-トキシンなどの毒素は、宿主細胞の細胞膜を穿孔することがよく知られている。しかしながら、そのような毒素に対する宿主の防御機構には不明な点が多く残されている。著者らは過去にオートファジータンパク質のATG16L1の低形成や欠損はα-トキシンに対する感受性が高いことを示した(Cell Host Microbe, 2015)。ATG16L1のノックダウンによってα-トキシン結合タンパク質ADAM10の細胞表面における発現は上昇したが、これはライソゾーム酸性化を介したものではなかった。ATGタンパク質には小胞輸送 (secretory autophagy) 機能があることが報告されている。ATG16L1ノックダウン細胞ではエクソソームが減少し、内包する成熟型ADAM10の減少も認められた。培養細胞にα-トキシンとともにエクソソームを添加したところ細胞死が抑制されたが、ATG16L1やADAM10のノックダウン細胞由来のエクソソームを用いた場合にはその抑制効果が見られなかった。α-トキシンはADMA10発現エクソソームと反応すると、その表面でオリゴマー化することが認められた。エクソソームはα-トキシンだけでなく、ジフテリア毒素に対する防御作用も発揮し、本研究で認められた作用はα-トキシン特異的なものではないことがわかった。以上より、オートファジータンパク質により放出を誘導されたエクソソームは細菌毒素に対するおとり受容体として機能し、感染防御に寄与することが示された。

POINT!

近年、脊椎関節炎 (SpA) に対する治療薬の開発が進められているが、関節癒合を十分に防ぐことはできていない。SpA患者のGWAS解析からは、IL23R, IL6R, IL12B, JAK2, TYK2など、3型免疫応答に関わる遺伝子が見出され、治療標的として注目されている。多くの種類の経口JAK阻害剤が開発されたことから、著者らはTYK2阻害剤に着目した。特異性の高いTYK2阻害剤NDI-031407は、IL-1β, IL-6, IL-23で刺激されたCD4⁺T細胞によるIL-17A産生を濃度依存的に抑制した。このとき、STAT3リン酸化が抑制されていた。そこで、SpAモデルであるSKGマウスにSpA誘導1週間後からNDI-031407を100mg / kg、1日2回経口投与したところ、症状スコアと関節の組織所見が改善した。所属リンパ節中のCD4⁺T細胞においては、NDI-031407投与によりIL-17A, IL-22産生細胞やRORγt⁺細胞の割合も低下していた。SpAにおいてはRORγt⁺ CD4⁺T細胞の増殖が亢進するが、この化合物によって増殖活性は低下した。活性化マーカーのICOS発現は減少し、PD1の発現は上昇した。SpAの別のモデルであるIL-23 mini circle静脈注射モデルでも同様の治療効果が認められた。IL-23を耳介に局所注射した場合、γδT細胞によるIL-17A産生が増加するが、NDI-031407投与により減少した。また、TYK2の変異マウスにおいてもIL-23誘導性のIL-17A発現は抑制された。TYK2変異により、IL-23によるγδT細胞のSTAT3リン酸化は消失した。以上より、新規化合物NDI-031407はT細胞によるサイトカイン産生の抑制を介したSpA治療薬となることが示唆された。

POINT!

ILC2には定常状態で存在するタイプと寄生虫感染に対する炎症時に機能するタイプの二種類が存在することが知られている。しかし、これら二種類のILC2が誘導され、組織や病態に応じた機能を発揮するメカニズムには不明な点が多い。著者らは2型炎症反応に重要なIL-33シグナルに着目した。定常状態の野生型マウスの腸間膜リンパ節にはLin^–KLRG1⁺CD25⁺ST2⁺ILC2 (ILC2^NAT, ST2: IL-33受容体) が認められ、蠕虫N. brasiliensisを感染させた個体ではこれに加えLin^–KLRG1⁺CD25^–ST2^–ILC2 (ILC2^INFLAM) が認められた。Il33^–/–マウスで同様の感染実験を行ったところ、ILC2^INFLAMの出現は著しく抑制され、虫体排除も障害された。IL-33をマウスに投与したところ、IL-25に効率は劣るものの、腸間膜リンパ節にILC2^INFLAMが誘導された。培養ILC2にIL-33を単独で添加した場合はST2発現の抑制は部分的であったが、IL-25とともに加えた場合はほぼ完全に発現を消失させたことから、ILC2^INFLAMの誘導にはこれらのサイトカインの両方が必要であることが示唆された。遺伝子発現解析の結果、N. brasiliensis感染やIL-33刺激によってILC2におけるtryptophan hydroxylase (Tph1) 発現が顕著に上昇することを認めた。Tph1は他の免疫細胞と比較して免疫細胞で高発現していた。そこで、Tph1^flox/floxマウスを作出し、Il7r^Cre/+マウスと交配することによりILC2でTph1を欠損させるシステムを構築した。Il7r^Cre/+Tph1^flox/floxマウスではN. brasiliensis感染に伴うILC2^INFLAM誘導と寄生虫排除能の低下を認めた。Tph1^Δ/ΔILC2のマーカー発現を解析したところ、ICOSを始めとした活性化マーカーの発現低下を認めた。以上より、IL-33はThp1を介してILC2を活性化し、寄生虫排除に寄与することが示された。

POINT!

赤脾髄に存在するマクロファージ (RPM) は赤血球の維持と鉄のリサイクルに重要である。著者らはかつて、ヘムがSPI-C発現を誘導し、鉄リサイクルを行うマクロファージ分化を誘導することを示した(Haldar, Cell, 2014)。今回、IL-33がSpic発現を上昇させることに着目した。IL-33の作用メカニズムを明らかにするために、IL-33受容体IL-1RL1欠損マウスの解析を行った。Il1rl1^–/–マウスでは生後6週以降でCD11c^loLy6G^loNK1.1^loSSC-A^lo細胞に占めるF4/80^loCD11b⁺RPM前駆細胞の割合には有意な変化を認めなかったものの、F4/80^hiCD11b^lo/–成熟RPMの割合は有意な減少を示した。また、soluble IL-1RL1を投与した場合も同様に成熟RPMの減少を認めた。このことから、IL-33はそのサイトカイン作用によりRPM分化を制御することが示された。これらのマウスでは、生後42週において脾臓の腫大が見られ、肝臓及び脾臓に過剰な鉄の沈着が見出された。IL-33受容体の下流シグナルを解析したところ、野生型RPMにおいてはIL-33刺激でERKのリン酸化が認められたがIl1rl1^–/–マウスではこのリン酸化が認められなかった。網羅的遺伝子発現解析の結果、単球からRPM前駆細胞への分化課程にGATA2とETS1が関与することが示唆された。IL-33の産生源の探索により、赤血球中に31 kDaの完全長のIL-33を発見した。Il33^–/–マウスに対する野生型赤血球の移入により、RPMの割合は増加した。したがって、赤血球中のIL-33はRPM分化に必要であることが示された。

POINT!

生体内の微量金属は酵素の活性中心などの重要な役割を有する。しかし、神経細胞への金属の異常な沈着はアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの発症につながる。こういった疾患の治療や早期診断という観点から、銅や鉄などの微量元素が着目されている。ALSの原因遺伝子として、SOD1, TDP43, FUSなどが明らかにされてきたが、大部分の患者において原因は不明であり、早期診断に有用なバイオマーカーの開発が望まれている。著者らは、ALS患者の遺体の歯および抜去歯(永久歯)に含まれる金属元素の解析をLA–ICP–MSにより行った。その結果、出生から15年以内に金属の異常な取り込みの増加が認められた(クロム: 10~15歳、マンガン: 0-6歳、ニッケル: 6–10歳、スズ: 0–2.5歳、亜鉛: 0–15歳)。ALS発症年齢が50~74歳(本邦)であることを考えると、極めて早期に疾患に繋がりうる異常の検出に成功したといえる。齲蝕や歯周炎により永久歯を抜去する機会は減少しているので、乳歯でも同様に金属の異常沈着を検出することができれば、侵襲の少ない早期診断が可能になると考えられる。

POINT!

血中IL-6レベルは運動中に急上昇しIL-6は運動能力を支持するが、運動中の血中IL-6の由来も、IL-6が運動能力を高めるメカニズムも未だ解明されてはいなかった。本研究で著者らは、運動中の血中IL-6の大部分が筋肉に由来し、IL-6が骨芽細胞を介して破骨細胞分化と血中への活性化型オステオカルシン放出を促進することを示した。さらに、骨芽細胞でIL-6受容体を欠損するマウスが筋肉でIL-6を欠損するマウスと同程度の運動能力の欠陥を示すことや、この欠陥がIL-6ではなく、オステオカルシンによって治療できることも示された。さらに著者らは筋肉由来のIL-6が運動中にオステオカルシン依存的に筋線維への栄養取り込みと異化を促進することを明らかにした。また、オステオカルシンとIL-6の間のクロストークがげっ歯類とヒトの間で保存されていることも示された。以上から本研究は、筋肉-骨-筋肉の内分泌軸が、運動中に筋肉の機能を高めるために必要であることを証明している。

POINT!

カスパーゼ依存性アポトーシスは、恒常性維持に関わる細胞ターンオーバーの約90％を占め、炎症、細胞増殖、および組織再生を制御する。アポトーシス細胞がどのようにこれらの多様な影響を及ぼすのかについて、完全には解明されていなかった。本研究で著者らは、アポトーシス細胞代謝産物セクレトームのプロファイリングを行い、アポトーシスを起こしたリンパ球とマクロファージは細胞膜を保持しながら特定の代謝産物を放出することが明らかとなった。これらの代謝産物のサブセット（スペルミジン、AMP、GMP、クレアチン、グリセロール3-リン酸、ATP）は、種々の刺激によって様々な初代細胞や細胞株でアポトーシスを誘導した後に放出される代謝産物と同様であった。さらに、アポトーシス代謝産物セクレトームは、単なる細胞内物質の受動的な排出によるものではなく、カスパーゼを介して細胞膜上でのパネキシン1チャネルが開くことで、代謝産物の選択されたサブセットの放出が促進されることが示された。また、特定の代謝経路（スペルミジン合成に関わる経路）はアポトーシスの間もアクティブで、放出される代謝産物は選択的であった。アポトーシス代謝産物セクレトームは、隣接する健康な細胞において炎症の抑制、細胞増殖、および創傷治癒を含む、特異的な遺伝子プログラムを誘導し、アポトーシス代謝産物のカクテル投与によって、炎症性関節炎や肺移植片拒絶を抑制することが明らかにされた。また、Cd4-creによりパネキシン1を欠損させたマウスではデキサメタゾン投与後の胸腺におけるアポトーシス胸腺細胞から周囲のミエロイド系細胞へのシグナルが著しく低下することも示された。これらの結果から、アポトーシス細胞が除去を待つ不活性な細胞ではなく、代謝物を‘good-bye’シグナルとして放出することで能動的に調節するという概念が示された。

POINT!

軟骨は無血管という特有の性質をもつが、栄養供給欠如が軟骨形成制御に関わるかどうかということや、そのメカニズムは不明であった。本研究で著者らは、骨移植とフィルターによる血管侵入の阻害実験によって骨の治癒過程における血管侵入の阻害が、骨格前駆細胞の軟骨形成性分化を促進することを示した。また、in vitro実験からこの過程は細胞外脂質の低下によって引き起こされることが分かった。脂質が不足すると骨格前駆細胞においてFOXO転写因子が活性化され、それらがSox9プロモーターに結合してその発現を上昇させる。Sox9は軟骨形成の開始に加え、脂肪酸β酸化を抑制することによって細胞代謝の調節因子としても機能し、それにより細胞を無血管状態に適応させる。著者らの結果は、脂質欠乏が軟骨形成コミットメントの重要な決定要因であることや、脂質欠乏状態におけるFOXO転写因子の役割、さらにSox9が非常に重要な代謝メディエーターであることが明らかになった。これらのデータから、骨格系細胞の運命決定には微小環境の栄養状態が重要であることが示唆された。

POINT!

窒素含有ビスホスホネート（N-BP）は、骨関連疾患に対して最も広く処方されている薬剤である一方、非定型大腿骨骨折や顎骨壊死などのリスクが問題となっている。N-BPはファルネシル二リン酸合成酵素の活性を阻害し、タンパク質のプレニル化を抑制するが、N-BPの薬理効果発揮のための他の細胞内因子については不明であった。本研究で著者らは、ヒトミエロイド系のハプロイド細胞株KBM7を用い、ジーントラップ法によってアレンドロネートに対する耐性が上昇する変異から、ATRAID遺伝子を同定した。ATRAID遺伝子欠損マウスでは骨量に差はなかったが、骨形成や骨強度の低下を示し、さらに閉経後及び老齢骨粗鬆症モデルの両方でアレンドロネートによる骨量回復効果が減少した。ATRAID欠損破骨細胞は、アレンドロネートによる細胞死とプレニル化阻害に対する耐性を示した。また、N-BPにより顎骨壊死を発症した多発性骨髄腫及び乳がん患者や、非定型大腿骨骨折を発症した骨粗鬆症患者のエクソームシークエンス解析を行ったところ、ATRAIDコード領域にレアな非同義置換が同定された。さらにデータベース解析により、N-BP治療を受けた患者のうち予後不良群ではATRAID発現がコントロール群と比較して50%程度であった。最後に著者らはHEK293T細胞を用いて、同定された非同義置換や50%程度の発現低下がアレンドロネートに対する感受性を上昇させる可能性を示した。以上から、N-BP治療の安全性を確保するためのATRAID遺伝子領域スクリーニングの必要性が示唆された。

POINT!

がん転移過程において原発巣から播種されたがん細胞は、酸化的ストレスをはじめとした様々なストレスにさらされる。そのため、転移の成立にはがん細胞の代謝状態の変化が必須である。筆者らは、まず悪性黒色腫患者由来がん細胞を血液循環中がん細胞数および遠隔転移の有無により高転移性がん細胞と低転移性がん細胞の２群に分類した。それらを免疫不全マウスの皮下に移植し、[U-¹³C]glucoseを注入することにより腫瘍内の代謝を追跡したところ、高転移性がん細胞と低転移性がん細胞では取り込む栄養素に差があり、特に高転移性がん細胞では乳酸の取り込みが増加していることがわかった。続いて、高転移性がん細胞ではMCT1(Monocarboxylate Transporter 1)の発現量が高いことから、MCT1阻害剤であるAZD3965を投与したところ、腫瘍内の乳酸取り込み量が減少した。また、MCT1の阻害は原発性皮下腫瘍の増大にはほとんど影響がなかったが、血液循環中のがん細胞数を減少させ、転移巣を縮小させた。加えて、MCT1の阻害は酸化的ペントースリン酸経路を抑制して活性酸素を増加させ、抗酸化剤の併用投与により転移抑制効果は打ち消された。さらに、同じメラノーマ細胞から単離したMCT1^high細胞とMCT1^low細胞を比較したところ、皮下移植による腫瘍の形成は同程度であったが、静脈内注入によりMCT1^high細胞はより多くの転移巣を形成した。以上の結果から、高転移性がん細胞ではMCT1依存性に酸化的ストレスを処理していることが示され、がん細胞間での代謝の差が転移能の差をもたらしていることが示唆された。

POINT!

大動脈瘤はアテローム性動脈硬化の患者で見られ、平滑筋細胞(SMC)におけるTGF-bシグナル異常が認められるが、病態との関連は不明だった。筆者らは、大動脈瘤の病態モデルApoe^–/–マウスに平滑筋特異的(ミオシン重鎖Cre) TGF-b受容体を欠損させたマウス(TGFβR2^iSMC-Apoe)を作製し、SMCにおけるTGF-bシグナルの大動脈瘤への関与を調べた。高コレステロール食を与え続けた場合、TGFβR2^iSMC-ApoeマウスはコントロールApoe^-/-マウスと比べ、動脈硬化プラーク進行と大動脈瘤形成が増悪した。TGFβR2^iSMC-Apoeマウスの動脈平滑筋では、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、マクロファージ様細胞が多く認められた。また、TGFβR2^iSMC-Apoeマウスでは間葉系幹細胞マーカーCD44とSca-1陽性細胞が顕著に増加したことから、TGF-b受容体欠損SMCはリプログラミングし、多分化能を獲得しているようであった。つまり、SMCがSMCではない細胞に分化転換してしまうことで大動脈瘤に繋がる可能性がある。TGFβR2^iSMC-Apoeマウスにおける分化転換に重要なシグナルを調べるためにscRNA-seq解析を行うと、TGF-bシグナル下流のSMAD2/3に負に制御されるKLF4の発現がTGFβR2^iSMC-Apoeマウスで増加したことがわかった。そこでTGFβR2^iSMC-ApoeマウスにKLF4を欠損させると表現型がレスキューされた。平滑筋のTGF-bシグナル異常により誘発されたKLF4発現が平滑筋リプログラミングを促進することで動脈硬化が起きていることが示唆された。

POINT!

線維症は、原因不明の不治の疾患である。筆者らは以前、Segregated-nucleus-containing atypical monocytes (SatM)が、肺線維症に中心的な役割を果たしていることを明らかにした。本研究において、筆者らは肺線維症の前段階でSatMが病変部位に動員されるメカニズムについて検討した。サイトカイン発現に基づくスクリーニングを実施した結果、SatMは細胞死を起こした非免疫細胞が産生するCxcl12によって病変部位へ動員されることがわかった。さらに、筆者らは肺繊維化に伴い、nuclear exosome targeting complexの構成要素であるRbm7が高発現することを見出した。Rbm7を欠損するマウスでは、ブレオマイシン誘導性の肺繊維化が抑制され、肺へのSatMの集積も認められなかった。より詳細な肺線維症の分子機序を解析した結果、Rbm7は非コードRNAであるNeat1の分解し、BRCA1の核内局在を変化させることで、細胞死を誘導することが明らかになった。以上の成果により、Rbm7は非免疫細胞の細胞死を誘導し、SatM動員することで肺線維症を促進することが示された。

POINT!

抗PD-1抗体ニボルマブに代表される免疫チェックポイント阻害剤はがん治療を大きく発展させた。一方で末期がん患者は骨転移の結果引き起こされるがん疼痛に悩まされているが、これまでPD-1阻害がどのように疼痛に影響するか分かっていなかった。本研究ではLewis肺がん細胞大腿骨移植モデルにおける骨破壊と疼痛がPD-1欠損マウスでは抑えられることを示されている。またPD-1阻害による骨破壊と疼痛の抑制は野生型マウスへの抗PD-1抗体の投与によっても再現されている。これらのPD-1阻害は破骨細胞分化を抑制するが腫瘍の進展自体には影響していないことは注目すべき点である。骨髄の腫瘍微小環境において、腫瘍細胞はPD-L1を高発現し、さらには可溶型PD-L1分泌することが判明した。可溶型PD-L1は破骨細胞前駆細胞に発現しているPD-1と結合しJNK活性化とCCL2分泌を誘導することが示された。誘導されたCCL2は破骨細胞分化を促進する上に、脊髄後根神経節のCCR2を介してがん疼痛を悪化させるが判明した。これらのことから、抗PD-1治療は破骨細胞分化とCCL-CCR2を介した求心路を阻害することで骨転移に伴う骨破壊と疼痛を予防することができることが示唆された。

POINT!

骨の強度は骨量と骨質に依存している。オステオカルシンは骨中で最も豊富な非コラーゲン性タンパク質で、骨芽細胞から産生されることで知られている。既報では、オステオカルシンは骨形成を阻害し、膵臓でのインスリン分泌や精巣でのテストステロン合成、筋肉量を調節するホルモンとして機能すると主張されていた。筆者たちは、BglapおよびBglap2遺伝子を欠失することにより独自にオステオカルシン欠損（Ocn^–/–）マウスを樹立した。このOcn^–/–マウスを解析したところ、骨量や糖代謝、テストステロン合成、筋肉量などは野生型と比べても正常であった。c-軸方向におけるコラーゲン細線維の配向度や生体アパタイト（BAp）結晶サイズも正常であった。しかしながら、普通ならコラーゲン細線維に対して平行であるc-軸の配向性が破綻しており、その結果骨強度が減少した。これらの結果は、オステオカルシンがアパタイト結晶c軸のコラーゲン線維に沿った配向性を制御することによって長軸方向の骨強度を維持することが明らかとなった。なお、オステオカルシンノックアウトマウスについては別のチームからも連報で論文が発表された（PLoS Genet., 16: e 1008361 (2020)）。この論文でも上述の結果と一致してオステオカルシンがホルモンとして作用しているような所見はほぼ認めないことを報告している。

POINT!

骨髄間葉系細胞は骨の恒常性や骨疾患に関わる様々な細胞を含む不均一な集団である。この集団は間葉系幹細胞を起源とすると想定されていたが、真の前駆細胞やどのように骨芽細胞や脂肪細胞に分岐しているのかについての詳細は不明であった。彼らはシングルセルトランスクリプトームを行うことでこれらを明らかにしようと試みた。異なる分化ステージでの間葉系前駆細胞を計算的に定義し、それらの二系統への分化経路を若齢、壮齢、老齢で調べた。すると脂肪細胞マーカーを発現するにもかかわらず脂肪滴を含んでいない特徴的な細胞を同定できた。脂肪細胞の非増殖性前駆細胞として、骨髄腔の内部と偏在する3Dネットワークを形成するストローマ細胞やペリサイトとして豊富に存在している。機能的には骨髄の血管を維持したり、骨形成を抑制していることがわかった。シングルセル解析によって、脂肪細胞系列前駆細胞が明らかになった。

POINT!

軟骨細胞の正常な機能は、骨の長軸方向への成長や骨折修復に必須である。軟骨細胞は、無血管環境下で活発に増殖・機能するため、ユニークな代謝要求を有する可能性が示唆されるが、その実態は不明な点が多い。著者らは、軟骨細胞分化のマスター転写因子であるSox9が、軟骨細胞におけるグルタミナーゼ１(GLS1)の発現レベルを上昇させることで、グルタミン代謝を促進することを見出した。Col2-CreによりGLS1を軟骨細胞特異的に欠損したマウスの解析から、グルタミン代謝は、1) アセチルCoA合成を介したヒストンアセチル化による軟骨細胞特異的遺伝子の発現制御、2)アスパラギン酸合成を介した軟骨細胞の増殖とタンパク合成の支持 3)グルタチオン合成を介した活性酸素の除去と軟骨細胞の生存促進、の３つの経路を介して、軟骨細胞の性質と機能を制御することを明らかにした。以上から、グルタミンは軟骨細胞の恒常性を維持する重要な代謝調節因子であることが示された。

POINT!

関節リウマチにおいて、滑膜組織は著しい過形成を生じて侵襲的になり、炎症と関節破壊を引き起こす。関節滑膜を構成する滑膜線維芽細胞には、関節腔に近接する「ライニング層」と、血管周囲を取り囲む「サブライニング層」の２つのサブセットが存在することが示唆されている。最近、関節リウマチでは、サブライニング層の滑膜線維芽細胞サブセットが顕著に増殖し、関節炎の病態を増悪する可能性が示された。しかし、サブライニング層の滑膜線維芽細胞が分化・増殖する分子メカニズムは不明であった。著者らは、シングルセルRNAシークエンス解析と滑膜組織オルガノイド技術を用いて、血管内皮細胞から供給されるNotch3シグナルが、サブライニング層線維芽細胞の分化に重要な役割を果たすことを明らかにした。リウマチ滑膜では、Notch3シグナルおよびNotch標的遺伝子がサブライニング層の滑膜線維芽細胞において顕著に上昇していた。Notch3の遺伝子欠損や、抗体によるNotch3シグナル阻害は、関節炎を緩和し、関節破壊を抑制した。以上の結果から、サブライニング層滑膜線維芽細胞は血管内皮由来のNotchシグナルによって制御されており、この間質系細胞のクロストークが、関節炎の病態形成において重要な役割を果たす可能性が示された。

POINT!

　多発性骨髄腫では骨髄中にがん化したプラズマ細胞が観察され、骨格への障害や痛みを伴う。近年治療法が進歩しているものの完治が難しいがんの１つであり、骨髄腫により誘導される骨破壊にはまだ不明な点が多い。成人の骨内膜には休止しているbone-lining細胞と呼ばれる扁平な細胞が並んでいるが、多発性骨髄腫におけるこれらの細胞の関与は不明である。筆者らは、骨髄腫のマウスモデルを用いてbone-lining細胞のサブセットと骨髄細胞をソーティングし、トランスクリプトーム解析を行い比較した。発現変動解析とエンリッチメント解析を統合し、BMP経路に着目し解析を進めた。in vitroでBMPを阻害すると破骨細胞分化、骨芽細胞分化ともに減弱した。また、骨芽細胞株UMR-106.01を用いてBMPシグナルを阻害すると、DKK1とスクレロスチン発現が減少した。一方、in vivoにおいてBMPを阻害するとbone-lining細胞層が肥厚した。骨髄腫マウスモデルにおいてBMPシグナルをin vivoで阻害すると、骨髄腫が増加することなく骨髄腫によって誘導された骨量低下を阻止することができ、骨髄中のスクレロスチンレベルを抑えることができた。この報告は骨髄腫が誘導する骨疾患におけるBMP経路の新規の関与を提示したばかりか、新たな治療戦略を示すものである。

POINT!

自己免疫疾患やアレルギーにおける理想的な治療戦略は、免疫応答を引きおこす抗原特異的なエフェクター/メモリーT細胞を制御性T（Treg）細胞に分化転換することである。著者らはサイクリン依存性キナーゼ8（CDK8）およびCDK19の阻害剤の使用、およびCDK8/19遺伝子のノックダウン/ノックアウトにより、抗原刺激をうけたエフェクター/メモリーT細胞、ナイーブCD4⁺およびCD8⁺T細胞のいずれにおいても、Treg細胞機能を制御する重要な転写因子であるFoxp3を誘導できることを示した。Foxp3の発現誘導は、STAT5の活性化と関連しており、TGF-b非依存性かつ炎症性サイトカインの影響を受けなかった。さらに、接触性過敏症と自己免疫疾患のマウスモデルにおいて、新しく開発されたCDK8 / 19阻害剤の投与と抗原免疫により、機能的に安定な抗原特異的Foxp3⁺Treg細胞の生成を介して疾患を効果的に抑制することに成功した。本研究成果はさまざまな疾患の治療法の開発に貢献するものと期待される。

POINT!

粘膜関連インバリアントT細胞（MAIT細胞）は自然免疫型T細胞の一種であり、MHC-related 1（MR1）によって提示されるビタミンB2合成中間産物（5-OP-RU）を認識するTCRを発現している。無菌マウスではMAIT細胞の数が著しく減少することから、共生細菌がその発生に関与していると考えられてきたが、胸腺内で発生するMAIT細胞に共生細菌がどう作用しているのか、そのメカニズムは分かっていなかった。本論文にて筆者らは、共生細菌の産生する5-OP-RUが胸腺に輸送され、MR1を発現する抗原提示細胞を介してMAIT細胞の発生を制御していることを明らかにした。5-OP-RUを経口・経皮投与した5-OP-RU:MR1 TCR Tgマウスの胸腺おいて、約1時間後にT細胞活性化が見られたことから、5-OP-RUが体外から胸腺に輸送され、抗原提示細胞によって提示されていることを明らかにした。胸腺内の細胞の中でもとりわけダブルポジティブ胸腺細胞は5-OP-RU依存的にMAIT細胞を活性化できることもin vitroの実験で示している。また、5-OP-RU産生能のない大腸菌（ΔRibD）と産生できる大腸菌(ΔRibE)を無菌マウスに移植すると、ΔRibEでのみMAIT細胞の数が回復したことから、5-OP-RUがMAIT細胞の発生に関与していることが示された。しかし5-OP-RUのみを投与した際にはMAIT細胞の減少が見られたことから、MAIT細胞発生を促進するためには細菌の産生する他の因子も必要であると考えられる。この因子の同定には至っていない。

POINT!

免疫チェックポイント阻害剤による治療(immune checkpoint therapy: ICT)は転移性去勢抵抗性前立腺がん(metastatic castration-resistant prostate cancer: mCRPC)の治療に有効であるとされるが、骨転移群には十分な効果がない。筆者らはICT後の前立腺がん組織内のヘルパーT細胞に関する遺伝子発現プロファイルを調べたところ、既報通りTh1関連遺伝子発現が増加していた。一方、骨転移を認めるmCRPC患者の骨髄を調べると、ICT後にTh1細胞ではなくTh17細胞が増加していることがわかった。また動物実験でICTの効果を検証したところ、CRPC皮下移植モデルではTh１細胞が増加し生存率が上昇したが、CRPC骨内移植ではTh17細胞が増加し、抗腫瘍効果を示さないことが分かった。骨髄内では破骨細胞の骨吸収時に放出される TGF-β が Th １細胞分化を抑制していると判明した。さらに筆者らはICTとTGF-β阻害を併用するとTh１サブセットを増加させ、さらにはCD8T細胞のクローン増殖を促進し、骨でのCRPCの退縮と生存率の向上を可能にすることを示した。

POINT!

骨膜には骨格系幹細胞が存在し、皮質骨代謝や骨折治癒において重要な役割を果たすと考えられているが、その特性に関しては未だ不明な点が多い。著者らは、骨膜に存在する Mx1陽性aSMA陽性の細胞集団（以下 Mx1⁺aSMA⁺細胞）が、骨格系幹細胞としての性質を有することを明らかにした。細胞系譜解析により、 Mx1⁺aSMA⁺細胞は生理的条件下において、骨外膜の骨芽細胞や皮質骨の骨細胞へと分化することが明らかとなった。骨折に伴い Mx1⁺aSMA⁺細胞は増殖し、骨折治癒部位における骨芽細胞の主要な供給源となることが示された。 Mx1⁺aSMA⁺細胞はケモカイン受容体である CCR5を高発現しており、骨髄中の免疫細胞由来の CCL5に引き寄せられ、骨折部位へ遊走する可能性が示され、実際に CCL5や CCR5を欠損したマウスでは骨折治癒が遅延することが明らかとなった。以上より、 Mx1⁺aSMA⁺細胞は骨折治癒において重要な役割を果たす、ユニークな骨膜幹細胞サブセットであることが示唆された。

POINT!

微生物叢と宿主の免疫機構は互いに影響しあっており、とくに発達早期における微生物との接触は正常な免疫機構の発達に非常に重要であり、その後の宿主の健康をも左右すると考えられているが、その詳細は明らかになっていない。近年、粘膜組織に遺伝子再構成されたTCRα/β鎖を発現しながらもNK細胞のマーカーも発現するMAIT (Mucosal-associated invariant T)細胞が多く存在していることが明らかとなっており、細菌感染などの生体防御に関与することが示されている。今回筆者らは、マウスの皮膚のMAIT細胞の発達には若齢期の特定の時期にリボフラビン合成能をもつ細菌と接触する必要があり、この影響は成熟後にも残るということを示した。また成熟後皮膚のMAIT細胞は皮膚の常在菌が産生するリボフラビン合成中間体を抗原としてMHC class I様分子MR1を介して応答し、増殖やIL-17A産生が活性化されることも示した。また皮膚のMAIT cellは他の組織のMAIT細胞とは異なる遺伝子発現パターンを有しており、創傷治癒を促進することも示した。

POINT!

破骨細胞は定常状態の骨リモデリングおよび関節炎の骨破壊において重要な役割を果たしている。これらの異なる状態における破骨細胞が同じ単球系の前駆細胞から生じるかどうかは不明であった。本研究で著者らは、パンヌスにおける破骨細胞は局所的に常在するマクロファージからではなく、もっぱら循環する骨髄由来細胞から発生することを明らかにした。さらに、マウスの炎症性滑膜における破骨前駆細胞を含む集団としてCX₃CR1^hiLy6C^intF4/80⁺I-A⁺/I-E⁺マクロファージ（著者らは関節炎関連破骨細胞形成性マクロファージ（AtoMs）と名付けた）を特定した。これらの細胞は生理的な骨リモデリングにおける従来の破骨前駆細胞とは異なるサブセットを含み、RNA-seq解析によってAtoMsの破骨細胞分化能を制御する転写因子としてFoxM1が同定された。実際に、Foxm1を欠損させるとin vitroおよびin vivoにおけるAtoMsの破骨細胞分化能が抑制され、Foxm1欠損細胞は関節炎に伴う骨破壊能が低下していた。さらに、関節リウマチ患者の滑膜にはマウスAtoMsに相当するCX₃CR1⁺HLA-DR^hiCD11c⁺CD80^–CD86⁺細胞が含まれ、FoxM1阻害剤であるチオストレプトンによってこれら細胞のin vitroでの破骨細胞分化が阻害されたことから、AtoMsやFoxM1が関節リウマチの新たな治療標的となりうることが示された。

POINT!

これまでの腱再生メカニズムの理解は不十分であり、腱の損傷は長期にわたる障害を引き起こす。本研究で著者らは成獣マウス膝蓋腱細胞のscRNA-seqを行い、tubulin polymerization-promoting protein family member 3（Tppp3）を発現する細胞集団が腱幹細胞としての能力を有することを同定した。細胞系譜追跡法によってこれらの細胞が損傷時に新しい腱細胞に分化し、自己再生できることが証明された。Tppp3⁺細胞の一部はPdfgraを発現しており、異所性にPDGF-AAで刺激すると新しい腱細胞の産生が誘導される一方で、Tppp3⁺細胞特異的にPdgfraを欠損させると腱再生が著しく抑制されたことから、Tppp3⁺Pdgfra⁺細胞に腱幹細胞が含まれる可能性が示された。また、Tppp3^–Pdgfra⁺のFAP（Fibro-adipogenic progenitor）が腱幹細胞ニッチに共存し、これらの細胞は線維化細胞を生じて腱治癒における線維性瘢痕形成前駆細胞となることも示唆された。これらの結果から、線維形成が負傷した腱で発生するメカニズムが明らかになり、PDGF-AAの臨床応用によって線維性瘢痕形成を防ぎ、腱再生を促進する可能性が示された。

POINT!

セデンタリーライフスタイル（ほとんど体を動かさないライフスタイル）や慢性炎症、白血球の増加は、アテローム性動脈硬化を増加させるが、定期的な運動が白血球産生に影響するかどうかは不明のままであった。本研究で著者らは、マウスの飼育環境にランニングホイールを設置し自発的な運動を促すと、6週間後に造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）数が低下することで炎症に関わる白血球数が低下することを見出した。運動により脂肪組織でのレプチン産生が減少し、その結果レプチン受容体陽性骨髄間質細胞におけるCXCL12などの静止期促進造血ニッチ因子発現を増加させ、造血幹細胞を静止期に留めることが明らかにされた。Prrx1-creER^T2; Lepr^fl/flマウスでの誘導性レプチン受容体欠損の解析の結果、レプチンの骨髄ニッチ細胞に対する影響がHSPCの増殖や白血球産生、心血管の炎症とアウトカムを調節することが示された。ランニングホイールを撤去すると血中・骨中レプチン量が急速に非運動群と同等の範囲に戻るが、運動が白血球産生とHSPCのエピゲノムやトランスクリプトームに与えた効果は、多くの遺伝子プロモーター領域のクロマチン構造を閉鎖型に変化させたことにより、数週間持続することが示唆された。また、急性敗血症モデルでは運動による血中白血球数の低下の影響はなく、むしろ生存率が上昇することも示された。さらに、心筋梗塞や循環器疾患患者のコホートにおいて、定期的な運動を続けている人の白血球数やレプチン濃度は運動しない人より低いことも示された。以上から、運動が骨髄造血ニッチの調節を介してHSPCに影響し、炎症性白血球数を減少させることが示された。

POINT!

大動脈石灰化は、将来の心血管イベントの独立した予測因子として重要である。著者らは、腹部大動脈石灰化または胸部下行大動脈石灰化の程度に関連するSNPを決定するためにGWASのメタ解析を行った。HDAC9とRAP1GAPの2つの遺伝子座は、ゲノムワイドレベルで腹部大動脈石灰化との有意な関連性が検出されたが、胸部大動脈石灰化に関連するSNPは検出されなかった。ヒト大動脈平滑筋細胞でHDAC9を強制発現させると石灰化が促進され、細胞収縮性が低下した一方、HDAC9の阻害剤添加やノックダウンは石灰化を低下させ、収縮性が促進された。血管石灰化モデルであるマトリックスGlaタンパク質欠損マウスでさらにHDAC9を欠損させると大動脈石灰化が40%減少し、生存率が上昇した。本研究によって、腹部大動脈石灰化に関連する遺伝子座が初めて同定され、これまでに未知であった血管石灰化発生におけるHDAC9の役割が明らかにされた。

POINT!

中枢神経系は免疫特権部位であると考えられてきたが、近年の研究から定常状態でもリンパ球浸潤が起こることが示された。また、T細胞が記憶などの脳機能に重要であることも明らかにされつつある。著者らは髄膜に含まれるT細胞の解析を行い、abT細胞が生後徐々に集積する一方、Vg6⁺サブセットを主体とするgdT細胞は出生時に既に髄膜に存在し、維持されることを見出した。髄膜のgdT細胞は定常状態で活性化しており、高い増殖性を示した。これらの細胞の多くはIL-17産生型であり、また、同部位におけるIL-17の主たる産生源であった。Il17a^–/–マウスやTcrd^–/–マウス、抗IL-17抗体を投与したマウスの行動実験では、これらのマウスの短期記憶機能に障害が認められた。Il17a^–/–マウス海馬の網羅的プロテオーム解析から、シナプス可塑性に関わるパスウェイの変化が認められた。電気生理学的解析により、このマウスの海馬では行動実験後の長期増強が抑制された。IL-17はグリア細胞におけるbrain–derived neurotropic factor (BDNF) の産生を促進した。Il17a^–/–マウスやTcrd^–/–マウスにBDNFを投与することにより短期記憶の改善が認められた。以上より、髄膜のIL-17産生gdT細胞の記憶機能における重要性が示された。

POINT!

高頻度の心理的な負荷は不安や鬱の原因となる。ストレス刺激への暴露は末梢T細胞の機能障害につながることが知られているが、ストレス–T細胞–脳機能を結ぶメカニズムは不明である。著者らは、電気ショック誘導性の不安モデルマウスの解析を行った。抗体を用いたCD4⁺T細胞の除去により不安様行動が減少し、電気ショックを経験したマウスのCD4⁺T細胞のRag1^–/–マウスへの移入で不安様行動の増加が見られたことから、CD4⁺T細胞がストレス下で脳機能を制御することが示された。不安モデルマウスのCD4⁺T細胞ではミトコンドリア関連遺伝子群の発現が変動し、ミトコンドリアの形態や糖代謝能に異常が認められた。不安モデルマウスの脳内ではロイコトリエンB4 (LTB4) の発現が高く、投与するとCD4⁺T細胞依存的に不安様行動が惹起された。LTB4に曝露されたCD4⁺T細胞ではMFN2やMIGA2の発現低下を伴うミトコンドリア断片化が認められた。Miga2^–/–マウス、Miga2^f/fCd4–Creマウス、Mfn1^f/fMfn2^f/fCd4–Creマウスでは不安様行動が認められた。Miga2欠損T細胞では糖代謝が低下する一方、プリン合成が亢進し、Miga2^f/fCd4–Creマウスの血清ではキサンチンなどのプリン代謝産物が大きく増加した。Miga2欠損によりCD4⁺T細胞ではIRF-1の蓄積が誘導され、IRF-1はプリン合成に関わる遺伝子のプロモーターに結合することが明らかになった。Irf1^–/–Miga2^f/fCd4–Creマウスではこれらの遺伝子発現の上昇や不安様行動の大部分がキャンセルされた。不安に関わる左側扁桃体の解析を行ったところ、Miga2^–/–マウスではオリゴデンドロサイトの増加を伴う同部位の肥大を認めた。これらの細胞はキサンチン受容体A1を発現し、Miga2^–/–マウスではプリン代謝と細胞増殖に関わる遺伝子群の発現変動が認められた。Miga2^–/–マウスやキサンチン投与マウスでは神経活動性の指標であるc-Fosの発現が上昇していた。以上より、ストレス刺激によりLTB4依存的にCD4⁺T細胞のミトコンドリア機能が障害されプリン合成が増加すること、プリン代謝産物のキサンチンはオリゴデンドロサイトの増殖を介して神経活動を亢進させ不安を誘導することが明らかになった。

POINT!

　神経系の発生に際して一部の神経細胞はアポトーシスに陥るが、死細胞が除去されるメカニズムは不明であった。著者らは各種遺伝子改変ゼブラフィッシュを用いてこのメカニズムを解析した。脊髄中のアポトーシス細胞は神経堤細胞 (NCC)と近接することが示された。これらの NCCの RNA-Seqデータを用いた gene ontology解析と pathway解析の結果、小胞体、ライソゾーム、エンドソーム、 V-ATPaseなどアポトーシス細胞の除去に関わる遺伝子群が見出された。そこで、これらの細胞が実際に死細胞の処理に関わるか、継時的に挙動を観察した。背側の神経幹から離れた NCCは腹側へ移動し、その一部はアポトーシスに陥った。細胞死の後、生存 NCCが死細胞へ遊走を始めた。死細胞の断片は近傍の NCCに貪食され、貪食した細胞内ではファゴソームがライソゾームと融合し小胞内が酸性化した。貪食 NCCの動態をさらに詳細に解析したところ、貪食胞の有無により遊走パターンが異なることが見出された。 IL-1RAの投与により遊走が妨げられたことから、以上のプロセスに IL-1が関与することが示唆された。

POINT!

ある種の遺伝子変異は発癌の原因となるが、変異の存在が必ずしも腫瘍の発生に繋がるとは限らない。皮膚には変異細胞の排除機構が備わっているが、発癌回避が排除機構のみに依存するかは不明であった。著者らは、毛包幹細胞に変異 Hras(Hras^G12V)をタモキシフェン誘導性に発現する皮膚癌モデルマウス (Hras^G12V/+K19 Cre–ERマウス )と K14 –H2B–GFPマウス、 CAG–tdTomatoマウスを交配することにより、上皮組織における Hras変異毛包幹細胞のレポーターマウスを作出した。このレポーターマウスの解析から、 Hras変異細胞は上皮組織中に一年以上残存することが確認され、変異細胞の排除以外の発癌回避機構の存在が示唆された。 Hras変異細胞は毛周期において高い増殖能を示したが、それによる組織構造の崩壊は認められなかった。また、これらの細胞は毛周期の成長期に増殖、退行期にアポトーシスしており、停止期の短縮は認めるものの、腫瘍性の挙動を示さなかった。 Hras変異に加えて TGF-β欠損を組み合わせたところ、グルーミングなどで皮膚損傷を起こしやすい部位で Hras変異細胞が増殖し、皮膚癌が発生した。毛包〜毛乳頭を除去しても発癌には至らないことから、表皮の損傷と Hras変異、 TGF-β欠損が発癌に必要であることが示された。以上より、皮膚には腫瘍性の変異細胞を除去するだけでなく、共存させつつ発癌させない機構が備わっていることが示された。

POINT!

味覚は毒物や腐敗した食餌を回避し、糖やミネラルなどの栄養を判別する生存に必須の感覚である。味覚は甘味、塩味、苦味、酸味、うま味の基本味からなり、各々の基本味は異なる味細胞(TRC)により認識される。著者らは、酸味を司るTRCのシングルセルRNA-Seq(scRNA-Seq)解析を行い、酸味を生じる機能分子の探索を行った。候補分子の一つ、膜タンパク質Otop1欠損マウスでは酸味に対する鼓索神経や膝神経節の活動性が低下していた。また、甘味受容体T1R3の遺伝子座にOtop1をノックインしたマウスを解析したところ、甘味受容体が甘味と酸味の両方に反応していた。以上より、Otop1は酸味を生じるのに必要十分であることが示された。より中枢側の神経回路を検討するために、膝神経節細胞のscRNA-Seq解析を行い、7つのクラスターを見出した。各クラスターのマーカー遺伝子欠損マウスや、マーカー遺伝子を発現する神経細胞を麻痺させる遺伝子改変マウスを用いた解析から、酸味を司る膝神経節細胞はPenk遺伝子を発現することが明らかになった。味覚刺激が入力される孤束核吻側部の解析を行い、プロダイノルフィン(Pdyn)発現ニューロンが酸味刺激に特異的に応答することを見出した。シナプス間を伝達されるウイルスを用いたラベリングシステムより、Pdyn発現ニューロンは膝神経節のPenk発現ニューロンに投射することが示された。同定された神経回路の機能を検討するために、光遺伝学的にPdyn発現ニューロンを刺激したところ、酸味への嫌悪行動が誘発された。以上より、末梢〜中枢の各階層で酸味を司る特異的な細胞サブセットと機能分子、マーカー分子が明らかになった。

POINT!

FGF23の異常はX染色体連鎖性低リン血症（XLH）などのいくつかの遺伝性疾患を引き起こす。FGF23は骨が主な産生源とされるが、その産生を制御する分子機構とシグナル伝達経路は不明であった。GNAS遺伝子はGsaとXLasをコードするが、本研究において著者らはXLasの欠損マウス（XLKO）が出生後早期にFGF23欠乏と高リン血症を呈することを発見した。XLKOマウスではPTH投与に応答したFGF23の上昇は正常であったが、骨でのPKCaやPKCdの発現は減少していた。骨細胞株Ocy454細胞でXLasを欠失させると、FGF23 mRNA発現量、イノシトール1,4,5-三リン酸産生量、およびPKCa/PKCdタンパク質量が低下した。PMA投与によってPKCを活性化すると、FGF23産生が上昇しXLKOマウスでの血中リン濃度が正常化した。Ocn-CreやDmp1-Creによって恒常的活性化型のGqa変異体であるGNAQ^G209Lをin vivoで発現させることによっても、PKC活性化を介してFGF23産生が上昇した。また、PKC活性化によるFGF23の上昇はERKシグナル伝達に依存していることが示された。さらに、XLHのモデルであるHypマウスの骨ではPKC活性が上昇しており、HypとXLKOの二重変異マウスでは、Hypマウスに比べ血清中FGF23量や血中リン濃度は低かった。本研究によって、未同定のGPCRからのG_q/11aやXLasを介したIP3-PKCによるFGF23産生経路が明らかにされた。

POINT!

IL-6ファミリーサイトカインであるIL-6や毛様体神経栄養因子（CNTF）は、マウスやヒトでのインスリン感受性を改善するが、2型糖尿病に対する治療応用は実現していない。この問題を解決するため、著者らはIL-6のgp130結合部位の1つをCNTFのLIF受容体結合部位に置き換え、IgGのFcドメインと融合したIC7Fcという人工サイトカインを設計した。IC7Fcはgp130、IL-6受容体、LIF受容体に結合する。IC7Fcをマウスに投与すると、食欲を低下させインスリン分泌を促進することで耐糖能と高血糖を改善し、体重増加と脂肪肝を予防した。さらに、IC7Fcは転写調節因子YAP1の活性化により骨格筋量を維持することも明らかにされた。また、Alb-Creによる肝臓特異的なIC7Fcの過剰発現マウスでは高脂肪食によって誘導される肥満に抵抗性を示すだけでなく、大腿骨の海綿骨量も上昇していた。カニクイザルに対するIC7Fc投与で明らかな副作用の兆候が観察されなかったことから、IC7Fcは2型糖尿病と筋萎縮症の治療のための次世代生物学的薬剤となる可能性が示された。

POINT!

マウスの指先やサンショウウオの四肢などにおける組織再生は神経依存性を示すことが知られている。除神経は再生を障害し、形態学的異常を生じさせるが、このプロセスに関わる幹細胞や前駆細胞に対する神経支配の直接的な影響は不明であった。著者らは、下歯槽神経を除神経するとマウス骨格幹細胞（mSSC）の細胞数低下や骨形成能低下などの機能的異常により下顎骨の修復が著しく低下することを見出した。この過程でmSSCはシュワン細胞への依存性を示し、シュワン細胞移植によって除神経後の骨修復能が回復することや、この過程にシュワン細胞から分泌されるPDGF-AAやオンコスタチンMなどの因子が部分的に関与することが示された。以上から本研究によってmSSCの神経依存性や下顎骨修復を促進するためのmSSC-シュワン細胞回路の重要性が明らかになった。

POINT!

自然免疫系細胞による病原体の直接的な認識は炎症応答に欠かせない。炎症応答において、体温、pH、酸素状態、栄養状態などの微小環境は激しく変動する。免疫系の細胞は特定の微小環境変化に対し適切な応答をするため、病原体の認識や活性化したパターン認識受容体(PRRs)を介してだけでなく、様々な微小環境へのセンサーも同時に使っている。ミエロイド系細胞のPRRシグナルへの応答や微小環境の変化の感知については研究が進んでいる一方で、「力と圧力」の自然免疫系への影響については、これらが免疫学的に重要な反応において細胞へのシグナル伝達を起こすにも関わらず、理解が進んでいなかった。今回筆者らは、呼吸により周期的な圧力が発生する肺などの臓器において、イオンチャネルであるPIEZO1がミエロイド系細胞の炎症性応答を惹起する周期的静水圧のセンサーとして機能することを明らかにした。マクロファージと単球に対する機械的刺激は、炎症性メディエーターや走化性因子の発現を誘導し、この炎症性機械感覚応答はPIEZO1に完全に依存していた。またミエロイド系細胞特異的にPIEZO1を欠損したマウスは緑膿菌の経鼻感染に対し高感受性となり、逆にミエロイド系細胞におけるPIEZO1シグナルの増強は肺線維症のマウスモデルの症状を悪化させた。これらの結果は、力と圧力が自然免疫系による炎症反応の主要な誘導因子であることを示している。

POINT!

骨の修復と再生には、骨形成能力のある骨格幹細胞および前駆細胞（SSPC）の活性化と遊走が必要である。本論文ではOsterix（Osx）を発現した経歴のある細胞が外傷に応じて骨格組織を修復するために、必要な一連の系列（骨芽細胞、軟骨形成細胞、および線維芽細胞）に分化できることを示した。これはOsx発現履歴のある細胞がSSPCである、あるいはSSPCを含んでいることを示唆するものである。コンディショナルノックアウトマウスの実験により、PDGFRβを欠損すると骨再生に必要なSSPCの増多とカルス形成を妨げることがわかった。骨修復中のSSPCの拡大、血管に沿った細胞遊走にPDGF-PDGFRβシグナル伝達が不可欠であることを示唆した。骨修復SSPCの遊走に関与するメカニズムをさらに調査するために、著者らはMMP-9およびVCAM-1がPDGF-PDGFRβシグナル伝達カスケードの下流エフェクターとして作用することを示した。以上より、著者らはPDGF経路が骨修復中にSSPC活性化の決定因子として作用することをin vivoで証明した。

POINT!

骨の石灰化は類骨にミネラル結晶が沈着することによって生じる。ミネラルの沈着の詳細な機序は依然として明らかになっていない。骨芽細胞に発現するEphrinB2蛋白は接触依存性に骨芽細胞の分化や類骨石灰化に関与しており、骨細胞においてもEphrinB2発現は保持されている。著者らは、骨細胞におけるEphrinB2発現と石灰化制御の関係を骨細胞特異的EphrinB2欠損マウスを用いて調査した。これらのマウスでは骨形態に変化は見られなかったが、骨脆弱性が見られた。類骨の一次石灰化は通常の速度で開始されたものの、二次石灰化の亢進が認められた。EphrinB2欠損骨細胞には、オートファジー関連の遺伝子に発現変動が見られ、細胞質内のオートファゴソーム数が増加していた。これらのミネラル過剰沈着およびオートファジー亢進状態はRhoA阻害により拮抗された。以上より、骨細胞におけるEphrinB2はRhoA経路依存的なオートファジーを抑制することで、二次石灰化を制御し、骨量非依存的に骨強度の維持に寄与している可能性が示唆される。

POINT!

加齢は骨折治癒遅延のリスクファクターである。加齢による骨折治癒障害の機構を研究する際に、筆者らが着目したのがApoEタンパク質である。ApoEはリポタンパク質であり、脂質代謝と脂肪酸輸送に関連する。近年ヒトにおけるApoE多型が骨のミネラル密度の減少と股関節及び脊椎骨折のリスク増加と関連することが報告された。しかし、骨折治癒と筋骨格の老化におけるApoEの役割は明らかになっていない。筆者らは、ヒトとマウスにおいて加齢により血中ApoEレベルが増加することを確認した。筆者らがWTおよびApoE欠損マウスの骨折治癒を評価したところ、ApoE欠損マウスの骨折仮骨内で骨沈着が高いことが明らかとなった。in vitroで分化中の骨芽細胞にリコンビナントApoEを添加すると、細胞分化とマトリックスの石灰化が抑制された。この処理により、骨芽細胞の代謝系にも影響が見られた。また、in vivoにおいて血中ApoEが骨修復において強力に抑制することを示した。さらに、siRNAを使用して血中ApoEレベルを低下させると、老齢マウスの骨折仮骨の骨沈着と機械的強度の増強を示した。本研究により加齢により増加した血中ApoEが骨芽細胞の代謝に影響して骨折治癒を阻害することが明らかとなった。この知見は高齢者の骨折治療における治療標的としてApoEが有用であることを示唆している。

POINT!

RANKLは破骨細胞分化や免疫組織形成に必須のサイトカインである。また骨粗鬆症、炎症性骨破壊、がんの骨転移等の病態にも関与している。RANKLは膜結合型と可溶型の二つの形態を持つが、生体における役割の違いについては詳細には判明していなかった。筆者らは可溶型RANKLを選択的に欠損したマウス（ΔSマウス）を作製し、可溶型RANKLの生理的・病的意義を検証した。6週齢で解析したところ、破骨細胞分化、リンパ節形成、胸腺髄質上皮細胞分化においてはΔSマウスと野生型マウスの間には差を認めなかった。したがって可溶型RANKLは生理的には必須ではないことが分かった。次にマウスがん細胞（悪性黒色腫・乳がん）を用いて左心室内移植による骨転移モデルを施行したところ、ΔSマウスでは骨転移が有意に抑制された。一方で、腫瘍骨転移部における破骨細胞数には差がなかった。なお卵巣や副腎などの骨以外の臓器への転移には差を認めなかった。これらの結果より可溶型RANKLは破骨細胞非依存性にがんの骨転移を促進することが分かった。

POINT!

　これまで、組織常在マクロファージは循環血液中の単球に由来するとされていたが、最近、その一部は発生初期に組織に定着したものであることが報告された。著者らは、関節滑膜のマクロファージの由来と機能の再検討に取り組んだ。マウス膝関節の透明化標本を観察したところ、平坦な形態のCX₃CR1⁺マクロファージが形成する膜状の連続した構造が関節腔を裏装していた。CX₃CR1⁺マクロファージは出生前から関節中に見出されたが、並体結合してもrecipientマウスに移入されないことから、発生初期に組織に定着・維持されると考えられた。滑膜を裏装するCX₃CR1⁺マクロファージと滑膜深部に見出されたCX₃CR1^–マクロファージのシングルセルRNA–Seq解析により、CX₃CR1^–マクロファージには、MHCIIやAQP1を発現するサブセットとRELM-αを発現するサブセットが存在することが明らかになった。偽時系列解析により、前者は後者およびCX₃CR1⁺細胞の前駆細胞であることが予測され、フェイトマッピングマウスの解析結果もそれに矛盾しないものであった。CX₃CR1⁺マクロファージ同士の接触部位にはタイトジャンクションが発達していたことから、これらの細胞が滑膜バリアの形成に関わることが示唆された。関節炎発症後早期にこの細胞間結合は消失し、CX₃CR1⁺マクロファージの連続性は失われ、MRI上で関節腔内への造影剤の流入の増加が認められた。CX₃CR1⁺マクロファージの除去は滑膜のバリアの破綻と関節炎初期の炎症症状の増悪につながった。タイトジャンクションを安定させるイマチニブが関節炎を抑制したことから、滑膜バリアは炎症を抑制することが示唆された。以上より、関節滑膜を裏装するCX₃CR1⁺マクロファージは関節局所で維持され、タイトジャンクションにより滑膜バリアを形成し炎症を抑制することが明らかになった。

POINT!

PINK1およびParkinはパーキンソン病の原因遺伝子であるが、Pink1^–/–マウスやPrkn^–/–マウスはパーキンソン病様の症状を強く発症することはないため、これらの遺伝子変異の他に何らかの引き金が存在することが指摘されていた。著者らは、過去にこれらのマウスの抗原提示細胞はLPS刺激によりミトコンドリア成分をMHCクラスI上に提示すること (MitAP) を見出した (Matheoud, Cell, 2016)。この知見から、CD8⁺T細胞を介した炎症反応がパーキンソン病の病態形成に関与する可能性に着想した。各種細菌をRAW264.7細胞に感染させたところ、グラム陰性菌、特に腸管病原性大腸菌 (EPEC) を感染させた際にMitAPが強力に誘導された。このMitAPは、Pink1^–/–マウス由来の樹状細胞では野生型細胞よりも高いレベルを示した。EPEC感染症のモデルに用いられるC. rodentiumを経口感染させたところ、Pink1^–/–マウスでは野生型マウスと比較して、脾臓や脳でミトコンドリア特異的かつIFNγを発現するCD8⁺T細胞が多く見出された。LPSとIFNγで刺激したPink1^–/–マウスの神経細胞とミトコンドリア特異的CD8⁺T細胞の共存培養ではMitAPが強く誘導された。Pink1^–/–マウスのドーパミン作動性ニューロンはLPSとIFNγ刺激下でCD8⁺T細胞と共存培養することにより細胞死に陥った。C. rodentium感染Pink1^–/–マウスでは、線条体ドーパミン作動性ニューロンの密度低下を伴う運動機能を認めた。以上より、感染に伴うCD8⁺T細胞を介した免疫応答がパーキンソン病の病態に関わることが示された。

POINT!

TRPV1⁺ニューロンは皮膚に広く分布し、痛みを司る神経細胞である。この細胞は感染や薬剤刺激に反応し、樹状細胞の活性化を介して17型自然免疫応答に関わることが報告されている。本研究で著者らは、TRPV1⁺ニューロンがこの免疫応答の誘導に十分であるのか、また、なぜこのニューロンが炎症反応に関与するのかを明らかにした。まず、光遺伝学的にTRPV1⁺ニューロンが活性化されるマウス (TRPV1-Ai32マウス) の皮膚に光照射を行ったところ、IL-17Aを産生するγδT細胞およびCD4⁺T細胞や好中球の浸潤、IL-23/IL-6/TNF-α/IL-17A/IL-22の発現上昇といった17型炎症反応を伴う表皮の肥厚・錯角化が認められた。よって、TRPV1⁺ニューロンの活性化は皮膚炎の誘導に十分であることが示された。薬剤による神経伝達の阻害実験から、これらの炎症反応は神経ペプチドの一つCGRP依存的であることが示された。次に、血流増加を指標に炎症の範囲を解析したところ、TRPV1-Ai32マウスでは光照射部位だけでなく、その周囲でも血流の増加を認めた。周辺部の血流増加は神経伝導に依存していたことから、局所でのTRPV1⁺ニューロン活性化が反射弓によって周辺部に炎症と感染防御を誘導すると考えられた。実際、細菌や真菌の感染は光照射部位の周辺部でも抑制されていた。以上より、TRPV1⁺ニューロンは感染部位局所だけでなく、その近傍にも予防的に感染防御反応を誘導することが示された。

POINT!

30年以上使用されてきた従来の遺伝子組み換えマウス作製方法では、雌マウスから受精卵を採取し、ex vivoでマイクロインジェクションを行い、別の偽妊娠マウスに移植する、という3つの主要なステップが含まれる。著者らは最近、これらの過程を不要とするGONAD法（卵管核酸送達によるゲノム編集）という方法を開発した。GONAD法は、Cas9 mRNAとguide RNA（gRNA）をE1.5胚に妊娠雌マウスの卵管に注入し、in vivoエレクトロポレーションを行ってin situで受精卵に成分を送達する方法である。その後、Cas9タンパク質またはCpf1タンパク質とgRNAをE0.7胚に送達する、改良されたGONAD法（i-GONAD法）を開発した。i-GONAD法は、ドナー一本鎖DNAテンプレートを加えれば最大1 kbのインサートを含むノックインモデルを作製することも可能である。この方法を用いれば、偽妊娠マウスやマイクロインジェクション装​​置、胚操作技術を必要とせず、比較的簡単な装置でゲノム編集マウスを作製することが可能となる。本プロトコルはi-GONAD法を実施するための非常に詳細なプロトコルである。

POINT!

従来、関節リウマチ（RA）における関節痛は炎症に起因すると考えられてきたが、関節炎の痛みと関節炎は少なくとも部分的には関連がない。本研究で著者らは、IgG免疫複合体（IgG-IC）の免疫受容体であるFcgRIが関節感覚神経のサブポピュレーションで発現し、ナイーブマウスに対するIgG-ICの関節内投与によるFcgRIのクロスリンクによって明確な関節炎は起こさずに、細胞体や末梢神経終末が直接活性化され急性の関節痛覚過敏を引き起こすことを示した。これらのIgG-ICの効果はPirt-Creを用いた感覚神経特異的なFcgRIノックアウトマウスで有意に減少した。抗原誘発性関節炎モデルマウスでは、関節感覚神経におけるFcgRI発現が活性化しており、抗体によるFcgRIの阻害または遺伝的欠失によって、関節の炎症には影響せずに関節炎の痛みと関節感覚神経の活動性亢進を有意に低下させた。以上から、感覚神経で発現するFcgRIは炎症性細胞での機能とは無関係に関節炎の痛みに寄与する可能性が示唆された。これらの発見は、神経細胞で発現するFcgRIがRAの痛みを治療するための標的となりうる可能性を示している。

POINT!

多能性間葉系間質細胞（MSC）は、骨格形成や維持、修復に生涯にわたって必要である。著者らは以前、成人骨格前駆細胞が多く含まれるMSCでの胚性パターン形成転写因子Hoxa11の特異的な発現と機能を報告した。本研究では、新しく作製したHoxa11-CreER^T2系統追跡システムを用い、発生期および出生後の両方の段階においてHoxa11-CreER^T2で標識したHox11発現間質細胞に、生涯を通じて真の骨格幹細胞ポピュレーションが多く含まれる可能性を示した。Hoxa11系列陽性細胞は、LepR-CreおよびOsx-CreERで標識される前駆細胞を多く含むMSCポピュレーションを生じさせ、これらの細胞よりも上流であることが示された。またHoxa11系列陽性細胞は、骨髄内および骨内膜・骨外膜上で生涯維持され、MSCマーカーを持続的に発現して骨格系に広範囲に寄与し、著者らが調べた全ての段階で、軟骨細胞や骨芽細胞、骨細胞、骨髄脂肪細胞などの骨格系細胞を生じさせることが示された。さらに、発生期や出生後にHoxa11-CreER^T2で標識した細胞は骨折損傷後に増殖し、骨折が成獣で誘導される場合においても軟骨や骨の再生に寄与したことから、Hox11発現細胞は骨格発生の最も早い段階から発生し、生涯を通じて自己複製する骨格系幹細胞が多く含まれることが証明された。

POINT!

Wnt阻害作用を持つ分泌型frizzled receptor protein 4（SFRP4）の機能喪失変異は、、パイル病(OMIM 265900)の原因となる。これは、広い骨幹端、皮質骨の著しい菲薄化、脆弱性骨折を特徴とする骨格障害を呈する。Sfrp4欠損マウスでは、皮質骨の菲薄化が、骨膜および骨内膜の骨形成の減少と皮質骨吸収の増加と相関していることが観察された。 Sfrp4欠損マウスの皮質骨におけるRank1/Opgの上昇は、骨芽細胞依存的な破骨細胞分化を示唆しているが、Sfrp4が破骨細胞分化に細胞自律的に影響を与えることができるかどうかは不明であった。 骨髄由来マクロファージをRANKLで刺激するとSfrp4発現が上昇することがわかった。さらに、Sfrp4がRANKL誘導性破骨細胞分化を有意に抑制することがわかった。古典Wnt/b-カテニンシグナル伝達の阻害は破骨細胞分化に対するSfrp4の効果と関連しなかったが、非古典的なWnt/Ror2/Jnkカスケードをブロックすると、in vitroで破骨細胞分化が著しく抑制された。さらにSfrp4欠損マウスで見られる骨内膜破骨細胞の増加は、Sfrp4欠損と合わせて破骨細胞特異的Ror2欠損マウス（CtskCreRor2fl/fl）にすると抑制され、皮質骨の菲薄化も減少していた。これらのデータは、破骨細胞分化制御におけるSfrp4のオートクリンおよびパラクリン効果を示すものである。

POINT!

アミノ酸トランスポーターはアミノ酸の細胞内への取り込みを制御する分子であり、様々な細胞内プロセスに関与する。L-Typeアミノ酸トランスポーター1 （LAT1）は、ナトリウム依存的に中性アミノ酸を細胞内に取り込む機能を有し、がんや神経疾患に関与する。アミノ酸の細胞内取り込みは、骨恒常性を制御していると考えられるが、その詳細なメカニズムは不明である。本研究において、筆者らは破骨細胞におけるLAT1が骨恒常性に重要であることを同定した。破骨細胞特異的にLAT1を欠損するマウスでは、破骨細胞数が増加し、骨量の低下が認められた。一方、骨芽細胞特異的にLAT1を欠損するマウスの骨は骨量、骨形成が正常であった。LAT1を欠損する破骨細胞ではmTORC1の経路が活性化された結果、破骨細胞のマスター転写因子であるNFATc1が核内に蓄積し、破骨細胞の分化および機能が亢進した。これらの発見は、破骨細胞におけるアミノ酸の取り込みが骨完全性の維持に重要な関連があることを示している。

POINT!

マイクロRNA(miRNA)は、転写後調節因子として遺伝子発現を制御することで、様々な生命現象において重要な役割を果たしている。これまでに、miRNA遺伝子の機能喪失型変異が、ヒト先天性疾患に関与する例は幾つか報告がされているが、miRNAの機能獲得型変異がヒト疾患に関与するといった報告は存在しない。著者らは、新たな常染色体優性ヒト骨異形成症を発症する２家系を見出した。同患者の全ゲノムシークエンスの結果から、マイクロRNA-140(miR-140)遺伝子の１塩基置換を同定した。この１塩基置換を導入したマウスでは、骨異形成症患者と類似する表現系が認められた。miR-140の変異は、軟骨細胞において本来の標的遺伝子の発現亢進だけでなく、変異miR-140の新たな標的遺伝子の発現低下を引き起こした。さらに変異型miR-140は、RNA結合タンパク質Ybx1と標的RNAとの結合を競合阻害することが明らかとなった。本知見は、機能獲得型miRNA変異がヒト先天性疾患の原因となる最初の証拠を示したと同時に、変異miRNAが持つネオモルフ作用の分子メカニズムの一端を明らかにした。

POINT!

シングルトン-マーテン(Singleton-Merten)症候群(SMS)は、骨減少症、動脈石灰化、歯科的異常（若年性歯周炎と歯根吸収）などを特徴とするまれな常染色体優性疾患であり、原因としてMDA5タンパクをコードする IFIH1遺伝子の機能獲得型変異が知られている。本研究において著者らは、MDA5の恒常的活性型変異を導入したマウスでは、I型インターフェロンシグナルの増強を介して骨リモデリングが低下し、SMS様の骨表現系を呈することを見出した。本知見により、I型インターフェロンシグナルの阻害が、SMS患者の骨病変に対する有用な治療戦略となる可能性が示唆された。

POINT!

　骨膜は骨表面のほぼ全域を被覆する。骨膜中のPeriosteum–derivedcell (PDC) は骨芽細胞など様々な細胞に分化する幹細胞 (MSC) である。PDCには様々なサブセットが含まれ、骨形成に重要であると考えられているが詳細は不明である。著者らはPDCサブセットの解析と制御機構の解析を行った。まず、免疫組織学的検討により、NestinまたはLepRを発現するPDCが骨膜外層に存在することが見出された。Nestin⁺PDCとLepR⁺PDCはそれぞれ若齢/成獣マウスに多く認められた。これらのPDCはコロニー形成能が高く、脂肪/軟骨/骨への分化能を示すなど、MSCの性質を有していた。次に、PDCの制御機構の解析を行った。TRAP⁺単核細胞はPDGF-BBを介してMSC遊走を誘導することが知られている。ジフテリア毒素を投与したTrap-cre iDTRマウス、Trap-cre Pdgfb^fl/flマウス、Nestin-creERT2 Pdgfr-β^fl/flマウス、LepR-cre Pdgfr-β^fl/flマウスではPDCの骨表面への動員の抑制と骨形成の低下が認められた。Trap-cre Pdgfb^fl/flマウスでは、骨再生の遅延も見られた。以上より、骨膜中のTRAP⁺細胞はPDGF-BBによりPDCを骨表面に動員することで骨形成と骨再生に寄与する事が明らかになった。

POINT!

炎症性疾患の基礎研究においては、免疫細胞のサブセット解析が精力的に行われている一方、組織の間質を構成する線維芽細胞のサブセットの検討は十分でない。著者らは関節炎組織の線維芽細胞サブセットに着目した。関節リウマチ患者の滑膜と血清移入関節炎モデル (STIA)マウスの滑膜において、fibroblast activation protein-α (FAPα)が高発現することを見出した。FAPα-luciferase-DTRマウスにジフテリア毒素を投与したところ、関節の腫脹と破壊が抑制された。また、これらのマウスではケモカイン、炎症性サイトカイン、RANKL、プロテアーゼの発現も低値を示した。Single cell RNA-Seq法によりSTIA滑膜線維芽細胞の表現系解析を行ったところ、特徴的な遺伝子発現パターンを示す複数のクラスターが見出され、ヒトサンプルのクラスターと共通するものも見られた。各クラスターの解析を行ったところ、FAPα⁺THY1⁺クラスターにおいては炎症性サイトカインやケモカインの発現が高かった。一方、FAPα⁺THY1^–クラスターはRNAKLやプロテアーゼの発現が高く、破骨細胞分化支持能を示した。STIAマウスの関節にこれらの細胞を移入したところ、FAPα⁺THY1⁺細胞は炎症を増強する一方関節破壊には影響せず、FAPα⁺THY1^–細胞は炎症への有意な寄与は見られないものの関節破壊を増強した。以上より、関節炎病変部の線維芽細胞には複数のサブセットが含まれ、病態形成において異なる機能を有することが示された。

POINT!

常染色体優性遺伝大理石骨病II型 (ADO2) はCLCN7が原因遺伝子の変異により骨吸収不全をきたす疾患である。CLCN7は骨以外にも多くの臓器で発現するため、ADO2における骨外病変の存在が想定されるが、系統的な解析はされていない。そこで著者らは、ADO2の骨外病変の詳細な検討を行った。ADO2患者の検査所見により、脳/血球/筋/腎などに異常所見が見られた。マウスではこれらの臓器と肺でClcn7発現が高かったため、ADO2モデルマウスの肺/腎/筋/脳の解析を行った。これらのマウスでは、TGF-βシグナル経路に関わる遺伝子群の発現パターンが野生型のそれと異なっており、マクロファージに特徴的な遺伝子や線維化関連遺伝子が高発現していた。これに一致して、ADO2モデルマウスの肺/腎/筋ではマクロファージの集積とSmad2/3リン酸化亢進を伴う線維化が認められた。さらに、脳組織では血管周囲の線維化、β-アミロイドの沈着、アストログリアの増殖が見られた。免疫細胞染色法により、変異CLCN7は野生型とは異なりGolgi体に蓄積し、細胞内小胞への移行やライソゾームの酸性化、オートファゴソーム形成に異常が認められた。変異Clcn7特異的siRNAを用いた治療実験では線維化の抑制、CLCN7の細胞内局在の異常の消失が見られた。以上より、ADO2の骨外病変とそのメカニズムの一端が明らかになり、また、核酸医薬がADO2の治療に有効である可能性が示唆された。

POINT!

間質は定義の乏しい非実質成分であるが、ほとんどすべての臓器の発生、恒常性、および修復において重要な役割を果たす。これまで、骨髄間質の幹細胞ニッチにおいて造血系の制御や、白血病の発症に関与する個別の集団が定義されてきた。本研究で著者らは、マウス骨髄間質の細胞分類とそれらの悪性化による機能障害を定義するために、1細胞RNAシーケンス法（scRNA-seq）を使用した。その結果、新たな線維芽細胞サブポピュレーションや、異なる骨芽細胞の分化トラジェクトリーを含むサブポピュレーションなど、様々な造血系の制御遺伝子を発現する17種の間質サブセットを同定した。また、急性骨髄性白血病を発症させると間葉系前駆細胞から骨芽細胞への分化が抑制され、正常な造血に必要な調節分子の発現が減少した。これらの結果は、特定の間質細胞が正常・異常な造血に関与する際の明確で一貫した定義を可能にし、血液疾患における間質を標的とした治療法を開発するための基盤となる。また、正常な組織機能を損なわせることによってがんの発生を可能にする、がん細胞と特定の間質とのクロストークに関するデータが示された。

POINT!

泌乳は、乳汁中に十分なカルシウムを供給するために骨量減少を引き起こすことが知られており、このプロセスには破骨細胞による骨吸収だけでなく、骨細胞性の骨小腔周囲の骨吸収が含まれるが、骨細胞が骨溶解に寄与する正確なメカニズムは不明のままであった。骨細胞はカテプシンK（Ctsk）などの破骨細胞が骨吸収を行う際に必要な遺伝子を発現し、そして泌乳はそれらの発現を上昇させる。本研究で著者らは、骨細胞でのCtsk欠損が泌乳期に観察される骨小腔面積や破骨細胞数の上昇、海綿骨量や皮質厚の減少、骨の脆弱化を阻止されたことを示す。さらに、骨細胞におけるCtsk欠損は骨でのPTHrP発現を増加させ、泌乳により誘導される血清中PTHの減少を阻止したが、血清中1,25(OH)₂Dの増加をさらに増大させた。これらの変化の結果、骨細胞でのCtsk欠損マウスでも血清中と乳汁中のカルシウム量が正常範囲に維持され、そのことにより新生仔においても正常な骨格発生が維持された。本研究は、生理的条件下の泌乳における骨細胞性骨小腔周囲リモデリングの基本的な役割を明らかにし、骨細胞由来のCtskが骨細胞性骨小腔周囲リモデリングだけでなく、泌乳に関連した高いカルシウム需要に応答したPTHやPTHrP、1,25(OH)₂D、破骨細胞分化、骨量減少の制御にも寄与するという遺伝的証拠を示した。

POINT!

多発性骨髄腫における骨溶解性病変の特徴は、治療が成功した後でも骨病変の回復に失敗することである。著者らは、治療に成功した患者の骨を調べ、骨髄脂肪細胞数は変わらないものの、骨吸収領域の海綿骨近傍に脂肪細胞が存在することを見出した。正常骨髄脂肪細胞と骨髄腫細胞とを共存培養すると、骨髄脂肪細胞がリプログラミングされ、破骨細胞と骨芽細胞の分化に影響するアディポネクチンやTNF-αなどのアディポカイン産生が変化した。これらの脂肪細胞では、PRC2がPPARγプロモーターにリクルートされることによってヒストンH3K27のトリメチル化を誘導し、PPARγ発現が減少する。著者らはマウスモデルにおいて、PRC2の構成因子でヒストンメチル基転移酵素活性をもつEZH2の脂肪細胞特異的欠損が脂肪細胞のリプログラミングを妨げ、骨髄腫細胞移植によって誘導された骨病変から回復することを証明し、PPARγプロモーターにおけるメチル化の重要性を確認した。さらに著者らは寛解期患者における骨病変数と骨髄脂肪細胞におけるEZH2発現との正の相関を実証した。これらの結果は、骨髄腫に関連した骨病変の発生における脂肪細胞の役割や、脂肪細胞リプログラミングを反転させることによって骨病変が治療できる可能性を明らかにした。

POINT!

抑制性の免疫補助受容体であるPD-1は、自己組織やがん細胞を攻撃するT細胞を強力に抑制するが、通常の免疫応答を抑制しない機構は不明だった。今回、筆者らは、CD80がPD-L1と結合することによって、PD-1/PD-L1結合が阻害されることを明らかにした。そのため、PD-1によるT細胞応答の抑制がなくなり、T細胞は正常に活性化されることがわかった。更に、CD80とPD-L1にそれぞれアミノ酸変異を導入したノックインマウスを作製した。これらのマウスにおいては、CD80とPD-L1が結合できず、PD-1/PD-L1結合による抗原特異的T細胞の活性化が顕著に抑制された。本研究により、PD-1は感染免疫応答などの生体に有益な免疫反応を抑制せずに、自己免疫疾患やがん免疫応答を選択的に抑制する機構が明らかになった。新たな自己免疫疾患の治療法開発につながることが期待される。

POINT!

骨髄線維症の患者の骨では骨硬化がしばし観察されるが、その発生機序は不明な点が多い。著者らは、50名の骨髄線維症患者の骨髄生検を解析し、破骨細胞の数が増加傾向にあること、破骨細胞がJAK2またはCALR(calreticulin)の変異を有していることを見出した。骨髄線維症患者の末梢血から誘導した破骨細胞は、健常者と比較してサイズが小さく、アクチンリングも不明瞭で、in vitroにおける骨吸収能が低下していた。以上から、破骨細胞の機能不全が骨髄線維症における骨硬化メカニズムの一端を担う可能性が示唆された。

POINT!

リンパ洞マクロファージ(SM)は辺縁洞マクロファージ（SSM）と髄洞マクロファージ(MSM)に分類され、自然免疫、獲得免疫の両方に関与する。筆者らはCcl19-Cre RANKL^fl/fl (RANKL^ΔCcl19)miceを用いて、リンパ組織オーガナイザー細胞と辺縁細網細胞に発現するRANKLを欠損させるとSSMとMSNが減少することを示した。さらにこのRANKL^ΔCcl19 マウスでは、ウイルス感染時における胚中心形成や形質細胞分化が阻害されることも示した。SM特異的にRANKを欠損するCD169-Cre RANK^fl/fl (RANK ^ΔCd169)マウスを解析したところ、SSMは減少するがMSNは変化がなかった。このことからSSMの分化はRANKLによって直接的に促進されることが示された。次に筆者らはProx1-Cre^ERT2 RANK^fl/fl (RANK^ΔProx1)miceを解析し、胚形成期と新生仔期にかけては、リンパ管内皮細胞に発現するRANKがSSMとMSMの分化に必要であることを示した。さらにRANK^ΔProx1を解析しリンパ管内皮細胞のRANK発現は炎症後に減少したSMの復元に必要であることを示した。以上より、リンパ組織の間葉系細胞とリンパ管内皮細胞は連携して、SM分化と炎症後の復元を支持する機能を持つことが判明した。

POINT!

造血幹細胞(haematopietic stem cell: HSC)は、移植後生体内で様々な血液細胞へ分化する能力を有し、免疫不全症や白血病の治療に用いられる。よって、体外で機能的なHSCを大量に増殖させる技術が求められているが、いまだ確立されていない。筆者らは、アルブミンを使用しない培養系を確立し、long-term HSCの大量培養に成功した。アルブミンの代替としてポリビニルアルコールを培養液に添加し、至適条件にて培養することで、機能的HSCがおよそ１ヶ月で236〜899倍に増殖した。それらの細胞は放射線照射をしていないマウスの生体内で長期にわたり定着し、様々な免疫細胞に分化することが確かめられた。したがって、これらの所見は基礎的幹細胞研究および臨床血液学の観点から重要な示唆をもたらす。

POINT!

幹細胞の不均一性は組織恒常性および修復に機能的に関連があると考えられているが、筋サテライト細胞サブセットの調節はほとんど不明であった。著者らは、in vivoにおいて誘導性Mx1-Cre遺伝子でラベルされたPax7⁺筋サテライト細胞の少数のサブセットが、Pax3を高発現し、かつreactiveoxygen species (ROS)レベルが低いことを見出した。Mx1⁺筋サテライト細胞は、移植時に強力な幹細胞活性を有していたが、量が比較的少ないため、内因性の筋肉修復時の寄与は最小限に留まることがわかった。一方、Mx1⁺筋サテライト細胞が劇的にクローン拡大を行うことで、放射線ストレスの選択的圧力による筋肉修復およびニッチ再増殖などへの貢献を可能にし、これは予備幹細胞（reserve stem cell, RSC）としての機能を有する細胞だと考えられた。Pax3を欠失させると、RSCのROS含有量が増加し、生存および放射線照射ストレス耐性を減少させた。これらの知見は、Pax7⁺筋サテライト細胞プールが、厳しいストレス下でもクローン増殖できる耐放射線性RSC集団を含んでいることを示した。

POINT!

副甲状腺ホルモン（PTH）の間欠投与（iPTH）は同化作用を誘発し、骨粗鬆症性骨量減少が抑えられることが知られている。しかし、PTHストローマの増殖やそれらの骨芽細胞系譜への成熟を刺激するメカニズムは不明である。マウスを用いた系列追跡実験により、iPTH処理は、レプチン受容体（LepR）-Creで標識される骨髄（BM）間葉系幹細胞（MSPC）の骨芽細胞分化を誘導したことがわかった。これは、PTH誘導性骨同化作用の一部がMSPCの骨芽細胞の関与のために発揮されることを示唆したが、これらの過程のin vivoにおける詳細についてはほとんど知られていない。著者らはLepR+ MSPCがiPTH処理に応答してI型コラーゲン（Col1）陽性成熟骨芽細胞に分化することを示した。骨芽細胞形成に伴い、Col1+成熟骨芽細胞の数は骨表面周辺で増加しており、それらのほとんどは増殖が停止している細胞であった。しかしながら、増殖状態にあるLepR-Cre標識細胞の数は、iPTH処理後に骨組織の近傍で増加した。骨芽細胞のマーカーであるSp7(Osx)およびCol1の発現レベルもまた、iPTH処理に応答してLepR⁺MSPC集団において増加した。一方で、脂肪細胞マーカーの発現レベルは、この集団では減少していた。これらの結果は、iPTH処理がLepR⁺ MSPCの一過性増殖を誘導し、それらの系統分化を脂肪細胞から骨芽細胞に偏らせ、成熟した骨芽細胞集団を形成することを示した。

POINT!

成体において血球系細胞は造血幹細胞（HSC）に由来するが、組織常在性マクロファージ（肝臓のクッパー細胞、脳のミクログリア、上皮のランゲルハンス細胞、肺の肺胞マクロファージ）は、HSCとは異なる胎生期の赤血球骨髄系前駆細胞（erythro-myeloid progenitor；EMP）に由来する。EMPは胎生8.5日に卵黄嚢で発生後、E10.5以前に胎仔肝臓に定着し、E16.5頃まで胎仔の赤血球、マクロファージ、顆粒球、単球を産生するが、これらはその後HSC由来の細胞により置換される。クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞は殆ど置換されないが、肺胞マクロファージは加齢に伴い徐々に置換されていくことが知られている。しかしながら、骨の組織マクロファージである破骨細胞の起源については、これまで不明な点が多かった。著者らは、EMPと HSCの両方で発現するCsf1r-CreでRANKまたはCsf1rを欠損したマウスでは、歯の萌出不全を伴う重篤な大理石骨病を若齢で発症する一方で、HSC系列のみで発現するFlt3-CreやVav-CreでRANKまたはCsf1rを欠損したマウスでは、歯の萌出は正常であり、若齢（４週齢）において骨に表現系を認めないものの16週齢以降に骨量増加を呈することを見出した。以上から、胎仔〜若齢期にかけてはEMP由来の破骨細胞が機能しており、徐々にHSC由来の前駆細胞により置換されることが示唆された。

POINT!

骨髄微小環境は造血に重要な役割を果たしていることは明らかではあるものの、分子的な相互作用やストレスに対する反応についての詳細は不明である。この報告では、定常状態と5-FUストレス下での骨髄に存在する細胞をシングルセルレベルで解析した。この解析により、骨髄ニッチ細胞の不均一性が明らかとなり、造血促進性成長因子、ケモカインおよび膜結合リガンドの細胞起源がわかった。データによると、ストレス条件下ではニッチ要素の相当な転写リモデリングが起きており、脂肪細胞に偏った血管周囲細胞も観察された。ストレス誘発性変化の中で、血管のNotchのリガンドであるDelta likeリガンドが負に制御されていた。血管のDll4がなくなると、造血幹細胞の骨髄性転写プログラムが未熟なうちに誘導され、細胞分化がミエロイド系細胞に偏ることがわかった。このようなシングルセル解析によって、骨髄ニッチがストレスに対して反応性が高く、不均一な集団であることが判明した。

POINT!

骨格幹細胞(Skeletal stem cell, SSC)が骨芽細胞の供給源として見なされてきたが、特定の条件下ではSSCの機能維持に影響がある。その結果、骨芽細胞が減少し、骨粗鬆症に罹患する場合もある。グルタミン代謝が様々な病態に関わっていることが報告されているので、筆者らはSSCにおけるグルタミン代謝に着目し、SSCの分化及び維持の制御について研究を行った。グルタミナーゼ（GLS）はグルタミンからグルタミン酸を産生し、グルタミン代謝における律速酵素である。マウス(PrxCre;Glsfl/fl)にSSC特異的Glsを欠損させると、野生型マウスと比べ、骨量が有意に減少した。更にin vitroでは、グルタミン代謝産物であるケトグルタル酸は、SSCが脂肪細胞への分化を抑制し、骨芽細胞への分化及びSSCの維持に重要であることがわかった。以上から、GLS活性を刺激しグルタミン代謝を亢進させることが、骨芽細胞や骨量を増やすための新たな治療手段として期待できる。

POINT!

播種したがん細胞が遠隔臓器のストローマでどのように進展するかは、転移における重要なプロセスであるが、十分な理解はされていない。過去の報告では上皮-間葉転換によるがん幹細胞の性質が転移の初期段階に必要である一方で、逆の間葉-上皮転換は転移先のがん細胞の成長に必要であることが示されている。筆者らは骨血管微小環境におけるE-selectinが、がん細胞の間葉-上皮転換と幹細胞の性質という逆説的な状況を誘導することを示した。E-selectinはがん細胞と直接結合し、間葉-上皮転換とWntシグナル活性化を誘導する。E-selectinの接着活性はα1-3フコシル基転移酵素（Fut3、Fut6）とGlg1に関連し、骨転移の形成に影響する。これらの知見は骨転移における骨血管微小環境のE-selectinの重要性を示すものである。

POINT!

骨肉腫の由来や、悪性化のメカニズムは不明な点が多い。著者らは、LKB1キナーゼをコードするがん抑制遺伝子STK11をCathepsin k(Ctsk)-Creで欠損したマウスでは、骨肉腫様の腫瘍病変を発症することを見出した。細胞系譜解析により、骨膜に存在するCtsk陽性の間葉系幹細胞が、腫瘍の原因細胞であることが示された。LKB1キナーゼを欠損した骨膜間葉系幹細胞ではmTORC1が活性化し、細胞増殖や骨芽細胞分化が亢進しており、mTORC1の阻害は骨肉腫様病変の進展を抑制した。以上より、Ctsk陽性骨膜間葉系幹細胞は骨肉腫の起源の一つであり、LKB1-mTORC経路が骨肉腫の有用な治療標的となる可能性が示唆された。

POINT!

咀嚼力の大小と顎の形との間には密接な関係があるといわれているが、強く噛むことが顎骨形態にどのような影響をおよぼすのかは不明であった。著者らは通常飼料よりも圧縮強さが大きい飼料を作製し、それを摂取したマウス(咀嚼強化マウス)の解析を行った。咀嚼強化マウスでは大脳皮質運動野が活性化、咀嚼回数・時間が増加し、咀嚼筋の筋線維幅径が増大した。咀嚼強化が顎骨形態に及ぼす影響をコンピューターシミュレーションしたところ、咬筋停止部の突出と下顎枝の短縮が起こり、顎骨に発生する応力が減少すると予測された。マイクロCT解析により、この予測と一致した変化が認められた。咀嚼強化マウスの顎骨では骨細胞におけるIgf1の発現上昇とSostの発現低下がみられた。培養腱細胞に伸展刺激を与えた骨細胞の培養上清を添加したところ、骨芽細胞分化が促進され、IGF-1に対する中和抗体によりこの促進効果は消失した。以上より、咀嚼強化により下顎骨骨細胞のIGF-1増加とSclerostin低下がおこり、強い力に耐えられるよう形態が変化することが示された。

POINT!

慢性的な心理的ストレスは免疫系の変調や骨折リスクの増加につながる。著者らはストレスによる免疫応答の変化が骨折治癒に影響すると考えた。慢性的従属集団飼育 (CSC) モデルによりマウスに慢性的ストレスを誘発したところ、血清中のIL-6、CXCL1、CCL2の発現が上昇した。骨折後早期の血清中のIL-6、CXCL1や骨折部位に形成される血腫中のIL-6の濃度は低下した。また、血腫中では好中球が増加し、T細胞が減少した。CSCマウスでは軟骨形成が抑制されることにより骨折治癒が遅延し、骨折部位の肉芽組織・仮骨では交感神経マーカーのチロシンヒドロキシラーゼの発現が高値を示した。アドレナリンβ遮断薬のプロプラノロールを投与したところ、CSCによる血腫中の免疫細胞浸潤の変動や骨折治癒の遅延が消失した。以上より、慢性的な心理的ストレスはβ-アドレンリン受容体を介して骨折時の炎症反応と骨折治癒における軟骨内骨化の両方を制御することが示された。

POINT!

幹細胞は組織の恒常性に重要であるが、老化の過程でどのように変化するかはよく分かっていない。著者らは皮膚の加齢変化における幹細胞の挙動に着目し、老齢マウスの表皮を解析した。同部位では上皮の萎縮や色素異常とともにヘミデスモソームの減少を認めた。各種ヘミデスモソームタンパク質のうち、17型コラーゲン(Col17a1)は老化に伴い発現が低下していた。Col17a1の発現は各種ゲノム/酸化ストレスにより減少した。Brainbowを用いて表皮基底細胞の多色標識解析を行ったところ、Col17a1発現強度とクローン形成能との間に正の相関が見出された。ケラチノサイト特異的Col17a1欠損マウスではBrainbowで標識された細胞が基底層から高頻度に剥離していた。Col17a1陽性基底細胞と陰性細胞の分裂像を詳細に検討したところ、前者が基底膜に平行に分裂する(基底層に維持される)一方、後者は基底膜に垂直に分裂する(基底膜より剥離する)ことが判明した。ヒトCOL17A1遺伝子を過剰発現させたCOL17A1Tgマウスでは、老齢マウスの上皮でも前者の分裂様式が高頻度に認められた。また、加齢に伴うメラノサイトの剥離や基底膜直下のPDGFRα陽性線維芽細胞の減少もCol17a1低下によるものであった。以上より、Col17a1は上皮幹細胞やメラノサイトを基底膜に繋留し、傷害された幹細胞を除去することで皮膚の恒常性を保つことが明らかになった。

POINT!

睡眠不足や睡眠障害は心血管疾患を含む複数の疾患リスクを増加させるが、この過程における分子・細胞のメカニズムについてはほとんどわかっていなかった。本研究で著者らは、マウスにおいて睡眠が造血を調節し、アテローム性動脈硬化症を防ぐことを発見した。睡眠断片化を受けた動脈硬化モデルマウス（Apoe欠損マウス）では、Ly6C^high単球や好中球が増加し、アテローム性動脈硬化層の形成が促進され、そこにLy6C^high単球や好中球、マクロファージなどが集積していた。さらに著者らは視床下部における睡眠に関連した因子の発現を調べ、視床下部外側野で発現し覚醒を調節する神経ペプチドであるヒポクレチン（オレキシン）の産生が低下していることを見出した。ヒポクレチン受容体は骨髄において好中球前駆細胞のみが発現しており、好中球前駆細胞によるCSF1の産生を抑制することによりミエロイド系細胞産生を制御することがわかった。ヒポクレチン欠損マウスやヒポクレチン受容体欠損マウスの骨髄細胞を移植したマウスではアテローム性動脈硬化症が亢進していた。一方でCSF1欠損マウスの骨髄細胞を移植したマウスに対する睡眠断片化や、睡眠断片化マウスに浸透圧ポンプを用いてヒポクレチンを連続的に補給すると、単球数が減少しアテローム性動脈硬化病変が減少した。以上の結果から、睡眠と造血やアテローム性動脈硬化症に関連する神経免疫軸の存在が示唆された。

POINT!

成長板軟骨は、哺乳類における多種多様な形状およびサイズの骨格形成に寄与する。しかしながら、軟骨の除去がどのように制御されるかということや、このプロセスが骨の形状をどのように調節するかに関してはよくわかっていなかった。本研究で著者らは、骨吸収をしていない破骨細胞サブタイプが骨幹端の成長板直下でH型血管内皮細胞に付随して存在することを見出し、血管関連破骨細胞（VAO）と名付けた。TRAPやインテグリンβ3はVAOでも発現していた一方、カテプシンKの発現や細胞のサイズは通常の（骨表面の）破骨細胞と比較して低く、核数も主に単核から２核であった。さらに、内皮細胞特異的なRANKL欠損マウスの解析から、骨軟骨境界部の内皮細胞はRANKLを発現し、VAOの形成を支持することが示された。通常の破骨細胞とは対照的に、VAOは軟骨吸収には重要ではない一方、H型血管の吻合を調節する。重要なことに、細胞特異的Mmp9欠損マウスの解析から、破骨細胞ではなく内皮細胞から産生されるMmp9が、軟骨を吸収して正常な骨成長の方向性を誘導するために必要不可欠であることが見出された。血管内皮細胞特異的Dll4欠損によりH型内皮細胞やVAOが減少し、さらにアレンドロネートにより血管の伸長を促進し破骨細胞を抑制することで新生血管の配向が乱れ、著しく歪んだ骨形状に至ることが示された。以上から、内皮細胞のタンパク質分解能が軟骨分解・骨の伸長に重要な役割を担い、VAOは主にH型血管内皮の芽状突起間の吻合を促進することが明らかにされた。

POINT!

乳がんの骨転移はしばしば、骨溶解性病変や筋力低下を伴う治療不能な状態を引き起こす。著者らは骨芽細胞分化および骨形成を抑制する可溶性Wnt阻害剤であるスクレロスチンの発現と乳がん骨転移の関係性を調べた。まず、非転移性MCF-7乳がん細胞株と比較して、転移性のMDA-MB-231乳がん細胞株はスクレロスチンを有意に高く発現しており、Sostに対するsiRNAを導入したMDA-MB-231細胞馴化培地はコントロール細胞馴化培地で誘導される骨芽細胞でのWntシグナル抑制を回復させた。また、スクレロスチンは健康な乳房組織では発現していなかったが、21％の原発性乳がんでスクレロスチンの発現が検出され、さらにより多くのトリプルネガティブやホルモン受容体陰性の乳がん組織でスクレロスチンの発現が確認された。重要なことに、乳がん骨転移モデルマウスでは、抗スクレロスチン抗体（Scl-Ab）により骨転移が抑制され、骨芽細胞による骨形成を上昇させ、破骨細胞による骨吸収を減少させることによって、がん細胞誘導性骨破壊を阻害した。一方、Scl-Abは肺や脳などの骨以外の部位における転移には影響しないことも示された。骨転移が進行する間、溶骨性骨吸収に伴って骨から放出されたTGF-b1により、筋肉ではNF-kBやp38シグナル伝達を介したPax7陽性サテライト細胞の増加を伴う筋線維の萎縮や筋力低下が引き起こされるが、Scl-Ab投与によりNF-kB・p38シグナル伝達、Pax7陽性細胞数、筋肉機能を正常化させ、乳がん骨転移モデルマウスの生存率を上昇させた。以上の結果から、Scl-Abが乳がん患者における筋骨格系合併症を治療するための新たな選択肢となる可能性が示された。

POINT!

変形性関節症は多くの場合加齢性の病気であり、軟骨破壊、滑膜炎症、骨棘の形成と肋軟骨の再構成を伴って関節が変形していくが、変形性関節症の原因となる分子メカニズムは不明である。現在、変形性関節症は代謝疾患と関連すると考えられてはいるものの、変形性関節症におけるコレステロール代謝の役割については十分に検討されていない。著者らは軟骨細胞のコレステロール代謝系であるCH25H–CYP7B1–RORαが変形性関節症の病態を制御するための重要な異化制御因子であることを明らかにした。変形性関節症の軟骨細胞はCH25HやCYP7B1などのコレステロール水酸化酵素の取り込みが増加しており、コレステロールが多い状態となっていた。さらに様々な生理機能を制御するオキシステロール代謝物の産生も増加していた。CH25HまたはCYP7B1を過剰発現させると実験的にマウスに変形性関節症を引き起こすことができ、一方でCH25HまたはCYP7B1をノックアウト、またはノックダウンさせると変形性関節症の症状を抑制することができた。さらにRORαがコレステロール代謝を変化させ、変形性関節症の誘導に関係していることを見出した。これらの結果から、変形性関節症は代謝障害に関連する疾患であろうことが示され、CH25H–CYP7B1–RORαの系が変形性関節症の治療標的になることが示唆された

POINT!

骨には骨髄中の免疫細胞が骨髄外へと遊走する出口が存在するはずだが、その詳細な経路や構造は不明であった。著者らは、好中球の骨髄からの遊走ルートを明らかにすることを目的とし、透明化試薬CLEARを用いて透明化した骨を、光シート顕微鏡や二光子レーザー顕微鏡、走査電子顕微鏡、マイクロCTを用いて詳細に観察したところ、何百もの毛細血管が骨髄から皮質骨を垂直に貫通し、骨膜循環系と交通していることを見出した。この経皮質骨血管は動脈および静脈を含み、好中球の輸送に寄与していた。ヒトの長管骨にも同様に経皮質骨血管が存在した。動脈血の80%以上、静脈血の59%以上が経皮質骨血管を通過しており、既知の栄養血管や類洞などの血管系よりも多くの血流量を含んでいた。この経皮質骨血管の数の制御には破骨細胞が関与しており、ゾレドロネートの投与は経皮質骨血管数を減少させた。また、関節炎モデルマウスでは数週間のうちに経皮質骨血管が新生されることが明らかとなった。本知見より、経皮質骨血管は骨循環系の中心的な構成要素であり、免疫細胞の輸送にも寄与することが示唆された。

POINT!

脳梗塞の慢性期における免疫系の役割は不明であった。今回著者らは、マウス脳梗塞モデルの慢性期においてTregが脳内に集積し、脳Tregと呼ぶべきユニークな性質を獲得することで、アストログリオーシス（アストロサイトの異常な活性化および増殖）を抑制することを見出した。脳Tregは他の組織のTregとは異なり、神経系に特徴的なセロトニン受容体を発現しており、セロトニンによって増殖・活性化した。抗うつ薬として広く使用されている選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)の投与は、脳内でセロトニン濃度を増加させることで脳Tregを活性化し、脳梗塞モデルの神経症状を回復させた。以上の結果より、脳Tregが神経炎症の制御において重要な役割を担うことが示唆された。今後、他の様々な神経疾患における脳Tregの役割の解明が期待される。

POINT!

炎症性疾患や感染は稀に貧血や血小板減少症を誘導するが、その原因は不明である。赤血球の分解は赤脾髄マクロファージ(Red pulp macrophage: RPM)が中心的な役割を担い、その分化には転写因子Spi-Cが必要である。今回、筆者らはToll-like receptor 7 (TLR7)シグナルが赤血球を貪食するマクロファージを分化誘導することを発見し、この細胞をinflammatory hemophagocytes (iHPCs)と命名した。iHCPは高い赤血球貪食能を有し、Spi-Cを発現していた。そのためRPMと近縁な細胞と考えられたが、遺伝子発現などの解析から両者は全く異なる細胞集団であることが示唆された。また、TLR7だけでなくTLR9もiHCPの分化を誘導した。iHPCの分化には両者の下流で制御される転写因子IRF5が必要であったが、Spi-Cは不要であった。生体内にてLy6Chi単球を除去することでiHPC依存的な貧血および血小板減少症が改善され、Ly6Chi単球がiHPCの前駆細胞であると示唆された。マラリアの弱毒株であるPlasmodium yoelii 17XNLの感染によってiHPCの増加と赤血球および血小板の減少が認められた。さらに、TLRシグナル伝達に必須のアダプタータンパク質であるMyd88を欠損したマウスでは、感染時におけるiHPCの分化が障害され、貧血が改善した。したがって、新たに同定されたiHPCが炎症および感染時における血球減少症の一因であると考えられた。

POINT!

線維芽細胞は器官形成や組織恒常性、免疫反応などにおいて多様な役割をもつ多面的な細胞である。線維性疾患においては、線維芽細胞は多量の細胞外マトリックスを産生し、これらが瘢痕や組織障害を引き起こす。逆に、関節炎において線維芽細胞は、メタロプロテアーゼや分解酵素を放出することで細胞外マトリックスの分解や、その後に見られる組織破壊を引き起こす。これら線維化と炎症における挙動の、一見すると正反対と考えられる線維芽細胞の機能がどのように制御されているのかメカニズムは不明であった。今回筆者らは線維化遺伝子発現プログラムの必須の調節因子として、転写因子PU.1を同定した。様々な線維性疾患の線維化組織でPU.1を発現している細胞の多くは線維芽細胞であることを見出した。PU.1の発現上昇は、線維化に関わる遺伝子セットと細胞外マトリックスを産生する線維化に関わる線維芽細胞へと転換する表現型を誘導する。対して、PU.1を薬剤により阻害したり、遺伝的に不活化したりすると、線維化ネットワークが崩壊する上に、線維化線維芽細胞の静止期線維芽細胞へ再プログラム化できた。PU.1発現コントロールによって、器官線維化からの回復ができる可能性を示した。